Интерпретация результатов определения этилового спирта в трупном материале может быть затруднена вследствие посмертных изменений под воздействием неблагоприятных условий окружающей среды [1—6]. Выявление веществ, характеризующих прижизненное употребление этилового спирта, является актуальной задачей судебно-медицинской экспертизы. В настоящее время известны различные метаболиты этилового спирта, которые можно использовать в качестве маркеров употребления алкоголя. Этиловый спирт и некоторые его метаболиты являются также продуктами микробиологического окисления органических веществ, что затрудняет диагностику прижизненного употребления этанола [7—9]. Этилглюкуронид и этилсульфат — прямые метаболиты этилового спирта, они могут использоваться в качестве маркеров его прижизненного употребления [10—12].

Цель работы — разработка и валидация быстрой воспроизводимой методики определения этилглюкуронида и этилсульфата, позволяющей сохранять и транспортировать объекты исследования без потери веществ путем нанесения образцов на бумагу.

Данный подход актуален при отсутствии соответствующего оборудования для определения метаболитов этилового спирта в судебно-медицинских подразделениях. В этом случае образцы можно передать в соответствующую лабораторию для анализа путем простой почтовой рассылки.

В Бюро судебно-медицинской экспертизы Д.З. Москвы были отобраны образцы трупной крови и мочи, не содержащие этилового спирта, а также образцы, содержащие разные концентрации этанола. Образцы исследовали на содержание алкоголя в крови по стандартной методике [13]. Этилглюкуронид (ETG) и этилсульфат (ETS) в крови и моче определяли методом тандемной масс-спектрометрии (ВЭЖХ/МС) на хроматографе Sciex ExionLC AD c масс-спектрометром Sciex 3200 QTRAP.

В качестве биологической матрицы для приготовления калибровочных стандартов и образцов контроля качества использовали плазму крови человека производства «Biological Specialty Corporation» (США), а также человеческую цельную кровь и мочу, заранее проверенные методом ВЭЖХ/МС на отсутствие целевых аналитов.

Для исследования использовали метанол («Merck», hypergrade for LC-MS), муравьиную кислоту («Merck», 98—100%), ETG и ETS, этилглюкуронид-D5 (ETG-D5) и этилсульфат-D5 (ETS-D5); изготовитель «Sigma Aldrich» (США). Экстракцию целевых аналитов проводили на центрифуге Eppendorf 5804R, вортекс Eppendorf Mixmate, дозаторы фирмы «Gilson» (США). Деионизированную воду для ВЭЖХ получали на аппарате AdronaCrystal B.

Стандарты для калибровочной кривой и образцы контроля качества (QC) готовили путем добавления к 975 мкл чистой биологической матрицы соответствующего раствора аналита (ETG и ETS) объемом 25 мкл. ETG и ETS предварительно растворяли в метаноле в концентрации от 2 до 400 мкг/мл. Концентрации образцов контроля качества в крови (плазме) составили: 50 нг/мл — нижний предел количественного определения (НПКО), 100, 150 нг/мл — QC для низких уровней концентраций (QCL), 500, 1000, 2000, 4000, 5000 нг/мл — QC для средних уровней концентраций (QCM), 6000, 8000 нг/мл — QC для высоких уровней концентраций (QCH), 10 000 нг/мл. Аналогично готовили образцы мочи, кроме 100 нг/мл вместо 50 нг/мл в качестве НПКО и 300 нг/мл вместо 150 нг/мл в качестве QCL.

Подготовку проб осуществляли путем нанесения биологического образца (25 мкл плазмы/крови, 15 мкл мочи) на бумажный носитель Whatman 903 Neonatal Screening Cards. Носитель высушивали в течение 1 ч при комнатной температуре. Область с нанесенным образцом вырезали и помещали в пластиковую пробирку типа Эппендорф вместимостью 2 мл. В пробирку добавляли 1000 мкл раствора ETG-D5 и ETS-D5 в метаноле с концентрацией 250 нг/мл для каждого вещества. Пробирку встряхивали на вортексе в течение 5 мин при 1000 об/мин, центрифугировали в течение 5 мин при 12 500 об/мин. Отбирали 850 мкл экстракта и переносили в пробирку типа Эппендорф вместимостью 2 мл. Экстракты выпаривали досуха в ротационном вакуумном испарителе при температуре 50 °C. Сухой остаток растворяли в 150 мкл деионизированной воды и анализировали.

Хроматографическое разделение целевых аналитов проводили на колонке Synergi Hydro-RP 100×3 мм, 2,5 мкм, 10 нм (Phenomenex), с предколонкой SecutiyGuard Cartridges C18 4×2 мм ID (Phenomenex). Скорость потока элюента 500 мкл/мин, температура колонки 50 °C, объем вводимой пробы 30 мкл. Мобильная фаза A — 0,1% раствор муравьиной кислоты в деионизированной воде, фаза B — 0,1% раствор муравьиной кислоты в метаноле. Время анализа 7 мин; время выхода ETS и ETS-D5 — 1,76 мин; ETG и ETG-D5 — 2,87 мин. Разделение проводили в градиентном режиме: 1,0 мин фаза A — 100%, фаза B — 0%; 1,0 до 3,0 мин фаза B доходит до 100%; 3,0 по 5,0 мин поддерживается 100% фазы B; 5,01 мин состав фазы возвращается к начальным условиям и поддерживается до конца анализа.

Детектирование проводили в режиме сканирования MRM (режим мониторинга множественных реакций), режим ионизации — отрицательных ионов. Напряжение в источнике ионов 4500 В, температура источника 500 °C. ETG, ETS и внутренние стандарты качественно и количественно определяли на основании времени удерживания и сигнала по двум MRM переходам для каждого аналита. Параметры масс-детектирования представлены в табл. 1.

Валидационные испытания проведены в соответствии с рекомендациями руководства Минздрава России и Европейского агентства лекарственных средств [14—16].

Линейность. Калибровочные стандарты анализировали в двух повторах каждого уровня концентраций. Калибровочные кривые построили путем расчета отношений площадей пиков аналита и внутреннего стандарта. Рассчитали коэффициенты корреляции для линейных уравнений регрессии. В трех аналитических циклах значения коэффициентов корреляции были выше 0,996 для ETG и ETS в моче и плазме. Графики калибровочной зависимости ETG и ETS имеют линейный вид и описываются уравнениями, представленными в табл. 2.

Точность и прецизионность. Оценку точности и прецизионности в пределах одного аналитического цикла проводили путем анализа образцов мочи, плазмы и крови человека, содержащих вещества ETG и ETS в концентрации на уровне НПКО, QCL, QCM и QCH в 6 повторах. Критерии приемлемости: коэффициент вариации не более 15% (не более 20% для НПКО), точность 100±15% (кроме 100± 20% для НПКО) (табл. 3).

На основе полученных данных можно сделать вывод о возможности использования калибровочных стандартов в плазме человека для анализа образцов трупной крови с помощью разработанного метода.

Нижний предел количественного определения оценивали путем измерения отношения сигнал/шум образца НПКО и холостого образца. Сигнал аналита из образца НПКО должен не менее чем в 5 раз превосходить величину сигнала холостого образца. Для расчета параметра сигнал/шум выбрали холостой образец, следующий после калибровочного стандарта с концентрацией 10 000 нг/мл (табл. 4).

Матричный эффект и степень извлечения. В образцы плазмы, крови и мочи человека из 6 различных источников после экстракции добавляли растворы ETG и ETS в концентрации на уровне QCL и QCH. Фактор матрицы определяли путем расчета отношения площади пика аналита и внутреннего стандарта как в присутствии, так и в отсутствии матрицы (раствор аналита и внутреннего стандарта).

Степень извлечения аналитов оценивали путем сравнения среднего отклика аналита в 6 образцах QCL, QCM и QCH по сравнению со средними откликами трех соответственно разведенных образцов чистых растворов (табл. 5).

Стабильность. Стабильность глюкуронидов изучали при различных условиях хранения. Определили стабильность ETG и ETS в крови при хранении в течение 2 нед в высушенном виде на бумажном носителе Whatman 903 (табл. 6).

Таким образом, данные в табл. 2—6 и на рисунке

Данную методику применяли для определения концентрации ETG и ETS в трупной крови и моче. Исследовали экспертные образцы крови и мочи, содержащие этиловый спирт от 0,4 до 5,2‰ (табл. 7).

Исследовали также 21 образец крови, не содержащей этилового спирта. Только в 2 образцах обнаружили значительные количества ETG и ETS. Возможно, большое содержание ETG и ETS обусловлено хроническим употреблением алкоголя. Этиловый спирт выводится из организма быстрее, чем его метаболиты, поэтому на момент исследования этанол не был обнаружен в крови, а ETG и ETS сохранялись в значительных количествах [18]. Затем эти образцы крови выдерживали при комнатной температуре в течение 2 нед и повторно исследовали на содержание алкоголя, ETG и ETS. В 9 образцах отметили образование этилового спирта, при этом ни в одном образце не обнаружили ETG и ETS. При хранении образцов наблюдали снижение содержания ETG и ETS, причем ETS значительно меньше, чем ETG (табл. 8).

Установили, что при употреблении этилового спирта в крови и моче взрослых людей наблюдается значительное содержание ETG и ETS. В заведомо отрицательных образцах крови погибших детей ETG и ETS не обнаружили. При гнилостных изменениях крови, даже при образовании этилового спирта, ETG и ETS не выявляются. Разработанная валидированная методика позволяет сохранять и транспортировать объекты исследования без потери веществ путем нанесения образцов на бумагу, что расширяет возможности ее применения. В экспериментах показано, что ETG и ETS хорошо сохраняются на бумажном носителе, относительная погрешность на превышает 6,4%.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

^1,2 e-mail: le1premier@gmail.com; https://orcid.org/0000-0001-8677-1946;