Определение давности повреждений головного мозга по изменениям ядрышкового организатора в астроцитах

В судебно-медицинской практике для установления давности повреждения нервной ткани головного мозга (ГМ) широко используют гистологические и современные гистохимические методы исследования. Эти методы дают представление о прижизненной метаболической и синтетической функциях нейронов и клеток нейронального окружения. Некоторые морфометрические показатели ядер астроцитов позволяют оценить изменение активности внутриклеточного белкового биосинтеза, вызванные деструктивными процессами. В нуклеарном пространстве клетки имеются ядрышки (одно или несколько), расположенные на хромосомах в области ядрышкового организатора (NOR — nucleolar organizing region), содержащие большое количество рибосомной ДНК (рДНК). Последняя, будучи аргирофильной, выявляется при окрашивании серебросодержащими красителями (silver-stained NOR, AgNOR). По мнению M. Krzyzanowska и соавт. [1], Ю.И. Пиголкина и Ю.Е. Морозова [2], по числу ядрышек, выявляемых в ядрах нейрональных клеток в проходящем свете, можно судить о биосинтезе белка при изучении биомеханики клеточного стресса, вызванного воздействием неблагоприятных факторов различной природы. Выраженность пролиферативной реакции и активности ядрышкового организатора в астроцитах в зоне и по периферии очага повреждения нейрональной ткани ГМ указывает на участие данных клеток на всех этапах воспалительно-репаративного процесса [3—7].

Цель исследования — оценка изменения числа ядрышек в ядрах астроцитов в острый посттравматический период черепно-мозговой травмы (ЧМТ).

Изучили параметры NOR (количество ядрышек и площадь области нуклеол) в ядрах астроцитов перифокальной зоны внутримозговых кровоизлияний с учетом давности ЧМТ от 2 ч до 18 сут. Проанализировали 26 случаев смерти мужчин и женщин в возрасте 36—50 лет от ЧМТ. Контрольную группу составили 17 умерших в возрасте 32—54 лет без признаков ЧМТ: смерть наступила от острой кровопотери в ближайшие минуты с момента повреждений. В обе группы не вошли случаи смерти лиц с хроническими заболеваниями и интоксикациями.

Объекты ГМ из перифокальной зоны кровоизлияний фиксировали в свежеприготовленном растворе 10% формальдегида в фосфатном буфере. На микротоме из парафиновых блоков готовили гистологические срезы толщиной 10 мкм (5 препаратов в каждом наблюдении). Дегидратированные срезы окрашивали свежеприготовленным водным раствором нитрата серебра в течение 45 мин. Дополнительно препараты окрашивали гематоксилином и эозином и по методу Перлса. Затем препараты исследовали в проходящем свете микроскопа при увеличении 40—1000.

Ядрышковые организаторы астроцитов окрашивались AgNOR интенсивно, имели четкие границы. Параметры AgNOR определяли раздельно с учетом давности ЧМТ: 2—4 ч, 5—48 ч, 3—11 сут, 12—18 сут. В одном гистологическом препарате исследовали в среднем 20 астроцитов с хорошо различимыми границами ядер и областей AgNOR. Всего изучили 2600 астроцитов в основной группе и 1700 астроцитов в контрольной группе.

Определяли следующие параметры: площадь ядра (мкм²); количество ядрышек (AgNOR number); площадь, занимаемую AgNOR нуклеолами в ядре (AgNOR area, мкм²); коэффициент отношения площади ядрышка к площади ядра [8]. Использовали оптический микроскоп, адаптированный с компьютерной системой анализа изображений (cellSens, «Олимп», Япония).

Статистические исследования выполняли с помощью программы Statistica, версия 10 («StatSoft, Inc.», 2011, www.statsoft.com). Для статистического анализа параметров AgNOR использовали непараметрические сравнения между группами. Различия в параметрах AgNOR оценивали посредством полуколичественных измерений [9].

Установили, что через 2—4 ч после ЧМТ по периферии очага повреждения происходит набухание астроцитов с формированием крупных набухших клеток. В их ядрах заметно слабое окрашивание кариоплазмы по сравнению с контрольной группой, без увеличения числа ядрышковых организаторов. При окклюзии просветов артериол, прекапилляров наблюдали периваскулярный отек (отек ножек астроцитов) и/или периваскулярное кровоизлияние без наличия AgNOR положительно окрашенных гранул в цитоплазме астроцитов. В четко определяемых контурах клеток астроцитов в участках, прилежащих к зонам повреждения ГМ, кариоплазма и цитоплазма не имели четких границ, положительно окрашенные гранулы были диффузно распределены по цитоплазме, ядрышко выглядело резко размытым или отсутствовало (рис. 1).

В 2 наблюдениях отметили аутолиз нервной ткани. Астроциты в них с набухшей цитоплазмой и фрагментацией отростков, которые отличались (при окраске AgNOR) от образованных прижизненно хаотичным диспергированием гранул по всей площади цитоплазмы клеток, стиранием и отсутствием ядерной оболочки.

Выявленные изменения позволили предположить, что глиальные клетки в зонах, непосредственно прилежащих к повреждению ГМ, в ближайшие часы с момента ЧМТ подвержены ареактивному некрозу, как и нейроны. Вследствие резкого набухания их отростки невозможно дифференцировать от нейронов и других глиальных элементов на препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином [10]. Кроме того, при оценке изменений глиальных клеток всегда необходимо учитывать влияние аутолиза на характер выявляемых признаков. Наиболее простым способом, позволяющим судить о наличии аутолиза, на наш взгляд, является сравнение степени выявленных изменений с характеристиками эритроцитов в полученных препаратах.

Первые достоверные признаки пролиферации глии по периферии повреждения ГМ выявляли в период 36—48 ч после ЧМТ. Это проявлялось увеличением числа нуклеол в ядрах. С начала 3-х суток нарастает пролиферация астроцитов мозга, появляются крупные, с обильной цитоплазмой, иногда многоядерные клетки. Использование методики AgNOR позволяет отметить достоверное увеличение числа ядрышковых организаторов и зафиксировать дополнительные ядрышки. Через 4—6 сут в некоторых астроцитах и макрофагах наблюдали накопление аргирофильных гранул.

Таким образом, увеличение числа точек репликации РНК в ближайшие сутки с момента повреждения ГМ, с морфологической точки зрения, может проявляться накоплением аргентоположительных гранул в ядрах. Астроциты — часть системы, обеспечивающей репаративно-компенсаторное ремоделирование ГМ, поэтому подобные изменения характеризуют их высокую метаболическую активность [11].

На 12—14-е сутки после повреждения ГМ нарастает число аргентоположительных гранул. Они располагаются на одном из полюсов клеток, конденсируются в округлые внутриклеточные образования как в астроцитах, так и в макрофагах (рис. 2).

Неопределенным в данных случаях является положительное окрашивание внутриклеточных гранул как AgNOR, так и по методу Перлса. Возможно, это объясняется наличием РНК в составе внутриклеточного пигмента и перекрестной реакцией гемосидерина с ионами серебра.

Реакция AgNOR является высокочувствительным индикатором белкового биосинтеза в нейронах и астроцитах. Метод можно использовать для оценки выраженности пролиферативной реакции в перифокальной зоне очага повреждения Г.М. Полученные результаты могут иметь диагностическую значимость в судебно-медицинской гистологии. Вместе с другими специальными методами исследования они позволяют установить давность ЧМТ. Дальнейшее изучение некротических и пролиферативных процессов глиальных клеток с помощью систем анализа изображений поможет определить роль клеток нейронального окружения в создании комплекса морфофункциональных взаимодействий при повреждении ГМ травматического и нетравматического происхождения.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

^1,2 e-mail: mrzv66@mail.ru; https://orcid.org/0000-0002-0594-257X