Актуальной проблемой современного общества является употребление наркотических и психоактивных веществ, особенно в молодежной среде. За последние годы в Российской Федерации отмечается повышенный спрос на так называемые аптечные наркотики, в частности, на лекарственные препараты — производные γ-аминомасляной кислоты (ГАМК). Наиболее популярен из них прегабалин (Лирика, Альгерика, Прегабалин-Рихтер).

Прегабалин высокоэффективен в основном в неврологической практике: при невропатической боли [1] как дополнительное средство, назначаемое больным с парциальными судорожными припадками [2], при фибромиалгии [3] в качестве средства, купирующего абстинентный синдром при зависимости от опиоидов [4]. Отмечена хорошая переносимость препарата. Уже на стадии исследования зависимости выявили эйфоризирующее действие у больных, злоупотребляющих седативными средствами, включая алкоголь. С осторожностью следует назначать препарат пациентам с лекарственной зависимостью в анамнезе [5—7].

Известны случаи острых и смертельных отравлений препаратом, а также комбинированные отравления при приеме с наркотиками, новыми синтетическими веществами, лекарственными препаратами группы антидепрессантов, противоэпилептическими средствами, производными бензодиазепина и рядом других (габапентин, диазепам, венлафаксин, амитриптилин, симвастатин и др.). В литературе имеются сообщения об отравлениях и злоупотреблениях исключительно прегабалином [4, 6, 7]. В связи с этим существует необходимость его определения при направленном исследовании.

Приказом Министерства здравоохранения РФ № 183н от 22.04.14 «Об утверждении перечня лекарственных средств для медицинского применения, подлежащих предметно-количественному учету» (с изменениями и дополнениями) прегабалин включен в группу иных лекарственных средств, подлежащих предметно-количественному учету и отпускается только по рецепту [8].

В литературе приводятся условия определения прегабалина в лекарственной форме (капсулы) и биологических объектах. Имеются данные об анализе прегабалина спектрофотометрическим методом, используя перевод вещества в более светопоглощающее соединение. Проводили исследования хроматографическими методами (высокоэффективная газожидкостная хроматография в тонком слое) [9—11], но нет данных о всесторонних исследованиях по выбору оптимальных условий выделения и определения прегабалина из биологического материала.

Цель исследования — разработка методик изолирования и определения прегабалина, в том числе для целей химико-токсикологического анализа (ХТА).

Исследовали водный раствор прегабалина (1,5 мг/мл); пробы биологической жидкости, содержащие прегабалин (модельные смеси мочи, плазмы крови).

Методы изолирования включали: жидкость-жидкостную экстракцию (ЖЖЭ), твердофазную экстракцию (ТФЭ). Полученные экстракты анализировали и с помощью газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС) по варианту абсолютной градуировки, для которой наблюдается линейность в диапазоне концентраций 10—100 мкг и 0,25—1,5 мг. Предел обнаружения прегабалина составил 5 мкг, предел количественного определения — 10 мкг.

Подготовка проб. Модельные смеси готовили путем смешивания 1 мл раствора прегабалина (1,5 мг/мл) и 1 мл биологической жидкости (моча, плазма). Жидкость-жидкостная экстракция. Для выделения прегабалина методом ЖЖЭ апробировали следующие растворители и их смеси: хлороформ/ацетонитрил (1:1), н-бутанол:этилацетат (1:1), этилацетат, диэтиловый эфир, этилацетат/диэтиловый эфир (1:1); этилацетат, насыщенный водой; диэтиловый эфир, насыщенный водой. Водные растворы прегабалина (модельные смеси мочи и плазмы, содержащие 1,5 мг прегабалина) доводили до определенного значения рН смеси, используя 10% разведенный раствор хлористоводородной кислоты, либо 10% раствор аммиака. Извлечение органическим растворителем из 10 мл модельной смеси проводили двукратно порциями по 2 мл. Время каждой экстракции составляло 2 мин. Отделяли органическую фазу в делительной воронке, фильтровали через бумажный фильтр с безводным натрия сульфатом. Сухие остатки после удаления экстрагента растворяли в 1 мл 95% этилового спирта и анализировали методом ГХ-МС. Предел выделения прегабалина методом ЖЖЭ — 30 мкг в пробе.

Твердофазная экстракция. Использовали методику, рекомендованную многими авторами для скринингового определения токсикологически важных веществ. Исследовали водные растворы прегабалина и модельные смеси мочи и плазмы крови, содержащие прегабалин (1,5 мг). Применяли систему с вакуумной камерой на 10 позиций Sartorius, насос высокого давления Sartorius, патроны SampliQ Evidex 200 мг/мл³ («Agilent», США).

Методика 1 [5, 12]. Кондиционирование сорбента проводили последовательным промыванием 95% этанолом и ¹/₁₅ М фосфатным буфером рН 4,8. Затем образец загружали в патрон, промывали последовательно фосфатным буфером ¹/₁₅ М и 10% раствором этанола. Патрон сушили под вакуумом в течение 20 мин и затем проводили элюирование: элюент 1 — н-гексан/этилацетат (2:1), элюент 2 — дихлорэтан/изопропанол/25% раствор аммиака (2:1:0,1). Элюаты испаряли досуха в токе воздуха. Предел выделения прегабалина — 15 мкг в пробе.

Методика 2. Для устранения факторов, мешающих выделению прегабалина, применяли элюент: н-бутанол/этилацетат/25% раствор аммиака (1:1:0,2). Кондиционирование и элюирование проводили, как в методике 1. Предел выделения прегабалина — 15 мкг в пробе.

Выход вещества контролировали с помощью ГХ-МС на газовом хроматографе Agilent 7890A, оснащенном высокоэффективной капиллярной колонкой HP-5ms и квадрупольным масс-спектрометрическим детектором Agilent 5975C. Данные провели в разработанных и оптимизированных для прегабалина условиях [13]. Идентификацию проводили по времени удерживания и масс-спектру базы данных NIST 2008.

В ходе эксперимента установили, что прегабалин не экстрагируется следующими растворителями: диэтиловым эфиром; диэтиловым эфиром, насыщенным водой. К факторам, которые могут мешать более полному извлечению прегабалина, можно отнести необходимость добавления в состав экстрагирующих смесей более полярного органического или амфифильного растворителя. Амфотерная структура прегабалина препятствует переходу вещества из ионизированной в молекулярную форму.

Установили, что прегабалин извлекается преимущественно из водных растворов методом ЖЖЭ, из слабокислых и нейтральных сред. Наибольшая степень извлечения смесью н-бутанол/этилацетат (1:1) при рН 4,0—6,0: 42,77, 43,09 и 42,91% соответственно, этилацетатом при таком же значении рН — 36,51, 39,55 и 41,64% соответственно (рис. 1).

При анализе модельных смесей мочи и плазмы крови средний выход прегабалина при использовании смеси н-бутанол/этилацетат (1:1) при рН 4,0—6,0 составил 40—42%, этилацетатом — 37% (рис. 2).

Метод ТФЭ вполне пригоден и более предпочтителен для выделения прегабалина из биологических жидкостей. Удерживание прегабалина в патроне, скорее всего, происходит за счет наличия первичной алифатической аминогруппы в структуре анализируемого вещества и присутствия в сорбенте сильного катионита — SO₃H.

При выделении исследуемого соединения элюентом состава — дихлорэтан/изопропанол/25% раствор аммиака (2:1:0,1) можно достичь выхода прегабалина 89,11% из модельных смесей мочи и 88,83% из модельных смесей плазмы крови (методика 1), а если использовать смесь н-бутанол/этилацетат/25% раствор аммиака (1:1:0,2) — соответственно 88,15 и 87,97% (методика 2). После прохождения через патрон смеси н-гексан/этилацетат анализируемое вещество в элюате не обнаруживается (рис. 3).

1. В ходе исследований выбраны оптимальные условия изолирования прегабалина из биологических жидкостей методами ЖЖЭ и ТФЭ.

2. Для достижения максимального выхода прегабалина из объектов испытаний в качестве экстрагентов можно применять смеси н-бутанол/этилацетат (1:1) при рН 5,0—6,0 для ЖЖЭ, дихлорэтан/изопропанол/25% раствор аммиака (2:1:0,1) и н-бутанол/этилацетат/ 25% раствор аммиака (1:1:0,2) для ТФЭ.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.