2,4-ди-трет-бутилгидроксибензол (агидол-10, далее 2,4-ДТБГОБ) — биологически активное соединение, представляющее собой прозрачные кристаллы от светло-желтого до темно-желтого цвета. Практически нерастворимы в воде (0,033 г/л при 25 °C), хорошо растворимы в этаноле, ацетоне, толуоле, нормальных парафинах и ряде других органических растворителей [1, 2].

2,4-ДТБГОБ получают путем промышленного синтеза; он также продуцируется некоторыми растениями и микроорганизмами. Выделенный из биологических организмов в виде экстрактов 2,4-ДТБГОБ изучают как ингибитор роста сорняков и средство для борьбы с патогенными грибами [3—5].

Соединение используется в производстве неионных поверхностно-активных веществ (ПАВ), пластификаторов, антиоксидантов для авиационного топлива, стабилизаторов, синтетических смол, пестицидов. Является метаболитом отдельных стабилизаторов и пестицидов. Известно применение 2,4-ДТБГОБ в медицинской промышленности [6—9].

2,4-ДТБГОБ, как и многие другие алкилфенолы, оказывает токсическое действие на теплокровных животных и человека. LD₅₀ для крыс при пероральном введении составляет 2400 мг/кг, для мышей при внутривенном введении — 100 мг/кг, при внутибрюшинном — 25 мг/кг, для кроликов при перкутанном введении — 2200 мг/кг [10—12]. Описаны отравления людей веществами из группы алкилпроизводных гидроксибензола, к которым относится и 2,4-ДТБГОБ, в том числе с летальным исходом [13, 14]. Это определяет интерес к 2,4-ДТБГОБ как к потенциальному объекту химико-токсикологического анализа. До настоящего времени 2,4-ДТБГОБ в химико-токсикологическом отношении изучен недостаточно.

Цель исследования — изучение особенностей определения 2,4-ДТБГОБ в тканях органов и крови.

Исследовали 2,4-ДТБГОБ фирмы «Sigma-Aldrich chemistry» с содержанием основного вещества 99% и более (определено методом газожидкостной хроматографии — ГЖХ).

Изолировали 2,4-ДТБГОБ из биологического материала путем настаивания с 16 растворителями различной химической природы: водой, водными растворами различной реакции, органическими веществами, относящимися к группам алканов, галогеналканов, алканолов, нитрилов, кетонов, аренов, гетероциклических кислородсодержащих соединений, алифатических карбоновых кислот и их алкиловых эфиров, диалкиламидов карбоновых кислот. Для этого предварительно готовили модельные смеси исследуемого вещества (частицы размером от 5 до 50 мкм) с мелкоизмельченной (размер частиц 0,2—0,5 см) тканью трупной печени, которые содержали по 25 мг 2,4-ДТБГОБ в 25 г биоматериала (средняя концентрация фенольных соединений в органах — оптимальных объектах исследования при летальных отравлениях теплокровных организмов). Приготовленные смеси выдерживали в течение 90 мин при 18—22 °С.

2,4-ДТБГОБ двукратно (каждый раз по 45 мин) изолировали из модельных смесей, соблюдая соотношение 2:1 между массами изолирующего агента и биологического материала. Оба извлечения, полученные из каждой модельной смеси, объединяли, фильтровали через бумажный фильтр, смоченный изолирующим агентом. Часть фильтрата очищали от соэкстрактивных веществ биологической матрицы методом адсорбционной хроматографии в тонком слое гидроксилированного сорбента СТХ-1А с размером частиц 5—17 мкм (пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ), используя подвижную фазу гексан—ацетон (9,5:0,5 по объему). При облучении хроматограмм УФ-светом 2,4-ДТБГОБ проявлялся на них в виде темного пятна с Rf =0,49±0,03. Анализируемое вещество элюировали из сорбента 5 мл этанола.

Количественное содержание 2,4-ДТБГОБ в извлечениях определяли методом УФ-спектрофотометрии по интенсивности поглощения этанольного элюата в области длинноволнового максимума (280 нм). Для расчетов использовали уравнение градуировочного графика. Далее определяли зависимость степени извлечения данного вещества из биологического материала оптимальным изолирующим агентом от продолжительности конт акта изолирующей жидкости с биоматериалом, кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и биологического объекта.

В найденных оптимальных условиях изолирования изучали зависимость степени извлечения 2,4-ДТБГОБ от концентрации анализируемого соединения в биологической матрице, используя модельные смеси, содержащие 1,25—50 мг 2,4-ДТБГОБ в 25 г мелкоизмельченной ткани печени.

Изучали особенности очистки 2,4-ДТБГОБ, выделенного из биоматериала, методом колоночной хроматографии (колонка размером 490×11 мм, заполненная 10 г сорбента L с размером частиц 40—100 мкм; элюент — система растворителей гексан—диоксан (8,5:1,5). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. 2,4-ДТБГОБ обнаруживали во фракциях методом ТСХ (пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ, подвижная фаза гексан—ацетон 9,5:0,5; объем фракции, наносимый на пластину, 5—10 мкл).

Параллельно осуществляли контрольное хроматографирование на колонке извлечения из 25 г трупной печени. Фракции элюата, в которых теоретически возможно присутствие анализируемого вещества, объединяли, эдюент испаряли, остаток растворяли в 25 мл этанола и измеряли оптическую плотность раствора при l=280 нм.

Для предварительной идентификации 2,4-ДТБГОБ изучена возможность применения нормальнофазного варианта ТСХ. Вещество хроматографировали вместе с близкими по структуре соединениями на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ.

Для подтверждающей идентификации 2,4-ДТБГОБ проводили ИК- и УФ-спектрофотометрию, а также хромогенную реакцию получения ацинитропроизводного. УФ-спектрофотометрию использовали для оценки количественного содержания анализируемого вещества в биоматериале.

Относительная ошибка среднего результата при определении 2,4-ДТБГОБ с помощью УФ-спектрофотометрии в субстанции составила 0,94% и менее (n=5; p=0,95).

Данные изолирования 2,4-ДТБГОБ из биологического материала 16 различными изолирующими жидкостями представлены на рис. 1. Согласно полученным данным, наибольшая степень извлечения рассматриваемого соединения достигается при настаивания модельных смесей с этилацетатом.

Установили, что для относительно полного извлечения вещества из биоматериала (ткань печени) этилацетатом достаточно двукратного настаивания биоматериала с изолирующим агентом при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае превышает количество биоматериала как минимум в 2 раза по массе (табл. 1). Продолжительность каждого настаивания должна составлять не менее 45 мин.

При хроматографировании в колонке с сорбентом L (размер частиц 40—100 мкм) с применением подвижной фазы гексан-диоксан (8,5:1,5) анализируемое вещество обнаружили во фракциях № 6—10 (11—20 мл).

В опытах с тканью печени, не содержащей 2,4-ДТБГОБ, установлено, что фоновое поглощение раствора ¼ сухого остатка фракций, в которых возможно присутствие данного вещества, в этаноле незначительно и не превышает 0,08 при l=280 нм.

Результаты исследования хроматографической подвижности 2,4-ДТБГОБ в тонких слоях сорбентов представлены в табл. 2.

Как видно из данных табл. 2, оптимальными для хроматографирования данного вещества в тонком слое нормально-фазового сорбента следует считать подвижные фазы гексан—ацетон (9,5:0,5), гексан—бензол (6:4), гексан—диоксан (8:2). В дальнейшем в исследованиях применяли подвижную фазу гексан—ацетон (9,5:0,5).

В качестве растворяющей среды для определения 2,4-ДТБГОБ с помощью УФ-спектрофотометрии выбрали этанол. В спектре 2,4-ДТБГОБ в среде этанола присутствуют две выраженные полосы поглощения с максимумами в области 210 нм и 280 нм.

Определили оптимальные условия проведения реакции получения окрашенного ацинитропроизводного 2,4-ДТБГОБ. Анализируемое вещество нитровали 10% раствором калия нитрата в концентрированной серной кислоте (ρ ≈ 1,830—1,832 г/см³) при температуре 18—22 ^оС в течение 5—7 мин, затем реакционную смесь в 3 раза разбавляли водой и переводили образующийся продукт нитрования в ацинитросоль путем нейтрализации раствора избытком 10% водного раствора натрия гидроксида до достижения рН 10,0—11,0.

С помощью УФ-спектрофотометрии строили градуировочный график и рассчитывали количество 2,4-ДТБГОБ по уравнению

А = 0,013445·С – 0,032215,

где, А — оптическая плотность, С — содержание анализируемого вещества в фотометрируемом растворе в мкг/мл. График линеен в интервале концентраций 2,5—60 мкг/мл. Коэффициент корреляции более 0,99. Открываемый минимум 2,4-ДТБГОБ составил 1,6·10^–6 г в 1 мл фотометрируемого раствора.

Изолирование. 25 г биологического объекта, содержащего 2,4-ДТБГОБ, настаивали 2 раза по 1,5 ч порциями этилацетата массой 50 г (55,4 мл) при перемешивании. Объединенное извлечение пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1,5—2,0 см, слой натрия сульфата промывали 20 мл изолирующего агента. Фильтраты объединяли, растворитель из объединенного фильтрата испаряли при комнатной температуре. Остаток растворяли в 2—2,5 мл смеси гексан—диоксан (8,5:1,5) и вводили полученный раствор в хроматографическую колонку размером 490×10 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100 мкм. Хроматографировали, используя элюент гексан—диоксан (8,5:1,5). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции с 6-й по 10-ю включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 18—22 °С. Остаток растворяли в 10 мл ацетона. В три выпарительные чашки (№ 1, № 2 и № 3) вносили соответственно 0,1—2,5, 4 и 0,1—2,5 мл ацетонового раствора и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном объеме ацетона и количественно наносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил UV-254. Хроматографировали, применяя систему растворителей гексан—ацетон (9,5:0,5) в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы детектировали в УФ-свете и идентифицировали анализируемое вещество по величине Rf, совпадающей с таковой вещества-свидетеля (0,49±0,03).

Идентификация методом ИК-спектрофотометрии. Остаток в чашке № 2 запрессовывали в таблетки с бромидом калия и исследовали пропускание в ИК области спектра в интервале частот 4000—400 см^–1, используя ИК-спектрометр Agilent Resolutions Pro. Анализируемое вещество идентифицировали на основе совпадения специфического набора значений максимумов полос пропускания с этими же характеристиками стандарта 2,4-ДТБГОБ (табл. 3).

Идентификация по реакции образования аци-нитропроизводного. К остатку в чашке № 3 прибавляли 0,5 мл 10% раствора натрия нитрата в концентрированной серной кислоте и выдерживали реакционную смесь в течение 5—10 мин при температуре 18—22 °С, после чего смесь разбавляли 1 мл воды и обрабатывали 4,5 мл 20% раствора натрия гидроксида. В присутствии 2,4-ДТБГОБ наблюдали появление желтого окрашивания.

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ пятно вещества вырезали из хроматограммы, помещали в пробирку, элюировали вещество из сорбента 95% этанолом 15 мин и исследовали поглощение элюата в интервале длин волн 190—360 нм. Соединение идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения (210±2 нм и 280±1 нм) (рис. 2).

Количественное определение. Содержание анализируемого соединения определяли методом УФ-спектрофотометрии по интенсивности поглощения этанольного элюата при l=280 нм, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывали на навеску анализируемого вещества, внесенную в биоматериал (табл. 4).

Как видно из данных табл. 4, разработанная методика характеризуется высокой степенью извлечения 2,4-ДТБГОБ из ткани печени (84,84—87,76%) и крови (86,87—90,56%) при концентрации анализируемого вещества в биоматериале 0,005—0,2%.

Открываемый минимум 2,4-ДТБГОБ составляет в ткани печени и крови соответственно 0,36 и 0,28 мг в 100 г биологического объекта.

Методика по ряду основных валидационных характеристик (линейность, селективность, правильность, прецизионность, открываемый минимум) соответствует критериям, принятым для биоаналитических методик.

1. Обоснованы преимущества и определены оптимальные условия изолирования 2,4-ДТБГОБ из биологического материала этилацетатом в режиме настаивания.

2. Разработана методика определения 2,4-ДТБГОБ в тканях органов и крови на основе изолирования этилацетатом и очистки в колонке силикагеля L 40/100 мкм.

3. Для идентификации и определения количественного содержания исследуемого вещества в биологических объектах предложены методы ТСХ, ИК- и УФ-спектрофотометрии, а также реакция получения ацинитропроизводного.

4. Разработанная методика валидирована по показателям линейности, правильности, прецизионности и открываемого минимума.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.