Незаконный оборот наркотических средств постоянно расширяется за счет новых синтетических психоактивных соединений. Так, на европейском наркотическом рынке в 2010 г. появилось 41 новое вещество, в 2011 г. — 49, в 2012 и 2013 гг. — 74 и 81 соединений соответственно. Синтетические наркотические соединения, так называемые дизайнерские наркотики, нередко становятся причиной серьезных отравлений и даже смерти в среде наркозависимых [1].

К числу наиболее часто встречающихся в судебно-химической практике психотропных веществ нелегального рынка можно отнести пировалерон [4’-метил-2-(1-пиролидинил)валерофенон, a-пировалерон, a-PVP)] и его многочисленные синтетические производные. В условиях роста распространения указанных соединений из числа «дизайнерских наркотиков» для мероприятий эффективного противодействия остро стоит проблема поиска и разработки быстрой диагностики. Вместе с тем, если вопросам внедрения современных экспертных систем физико-химической идентификации уделяется много внимания и посвящено значительное количество работ в нашей стране и за рубежом [1—3], то методы предварительной подготовки биологических проб к этапу инструментального исследования, как правило, ограничены жидкостной и твердофазной экстракцией [2, 4].

В качестве этапа пробоподготовки метод экстракционного вымораживания (МЭВ) уже находит свое практическое применение в химико-токсикологическом анализе для решения фармакологических и биохимических задач [5—9]. В его основе лежит способ извлечения аналитов, сочетающий экстракцию и вымораживание, использующий перераспределение целевых веществ между жидкой органической фазой незамерзающего растворителя и образующейся твердой фазой льда во время замораживания пробы после добавления экстрагента.

Применению экстракционного вымораживания в пробоподготовке способствует ряд его выгодных качеств. Существенным преимуществом МЭВ над сорбцией и твердофазной экстракцией является отсутствие затруднений при исследовании дисперсных систем, что важно в анализе биологических объектов. МЭВ не требует сложного лабораторного оборудования, его эффективностью и избирательностью можно управлять, варьируя условия (рН, температура) и полярность экстрагента [6, 10]. В отличие от жидкостной экстракции при МЭВ можно применять гидрофильные экстрагенты без дополнительной модификации пробы, в частности без высаливания. Экстракты, получаемые при использовании ацетонитрила, совместимы с обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ).

Цель исследования — изучение возможности применения экстракционного вымораживания в условиях действия поля центробежных сил (ЭВЦ) в качестве этапа предварительной подготовки пробы при газохроматографическом определении пировалерона в моче [11, 12].

Образец пировалерона в виде белого порошка получен в качестве вещественного доказательства. Экстрагентами служили ацетонитрил сорта «0» (НПК «Криохром», Россия) и изоамиловый спирт марки ЧДА (ЗАО «Вектон»).

Экстракцию пировалерона из модельных образцов мочи проводили в стеклянных виалах вместимостью 12 мл, диаметром 19 мм, высотой 65 мм (фирма «National Scientific») с герметично завинчивающимися пробками, оснащенными силиконовыми прокладками (фирма «Chromacol»).

Модельные смеси пировалерона в ацетонитриле готовили на аналитических весах ЛВ-210-А (ЗАО «Сартгосм» Санкт-Петербург, Россия) с погрешностью взвешивания, не превышающей 0,5 мг.

Идентификацию пировалерона вели методом ГХ-МС на хроматографе Focus SSL/DSQ с масс-селективным детектором DSQ II («Thermo Scientific», США) в стандартных условиях энергии ионизации 70 эВ по базе данных NIST. Капиллярная колонка TR-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм и толщиной пленки неподвижной фазы 0,25 мкм.

Дополнительную иденификацию по индексам удерживания и количественное определение пировалерона в модельных смесях и получаемых экстрактах осуществляли на газовом хроматографе КристалЛюкс («МетаХром», Йошкар-Ола, Россия) с термоионным азотселективным детектором. Условия хроматографирования: температура детектора 270 °C, инжектора 270 °C, программированный нагрев термостата колонки (нагрев от 140 до 180 °C со скоростью 10 °С/мин, затем до 210 °C со скоростью 3 °С/мин, после чего до 250 °C со скоростью 10 °С/мин); капиллярная колонка HP-5MS длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщиной пленки стационарной фазы 0,25 мкм. Скорость газа-носителя азота составляла 30 мл/мин (режим — без деления потока).

Полученный образец пировалерона идентифицировали методом ГХ-МС с использованием базы данных NIST и литературы [2, 3, 13]. Дополнительно, для повышения надежности идентификации установили его индекс удерживания в системе н-алканов, поскольку известно, что производные фенилэтиламина MDPV и α-PVP имеют единственный характеристичный ион со значением m/z=126, но существенно отличающиеся индексы удерживания [13, 14].

В молекулярной структуре пировалерона есть атом азота, поэтому представленный образец изучали и идентифицировали по индексу удерживания на газовом хроматографе с термоионным азотселективным детектором. В отсутствие стандартного образца на основании метода внутренней нормализации [15], когда с соответствующими допущениями сумма всех присутствующих хроматографических максимумов, исключая растворитель, принимается за 100%, ему присвоена квалификация содержания пировалерона 98%.

В результате оптимизации процедуры пробоподготовки предложена следующая схема анализа мочи:

— из пробы мочи берут 2 аликвоты объемом по 9 мл в герметично закрывающиеся стеклянные виалы;

— в одну (проба) вносят 1,5 мл ацетонитрила и 0,25 мл изоаминола;

— в другую (проба с добавкой) добавляют 1,5 мл ацетонитрила, содержащего известное количество α-PVP, и 0,25 мл изоаминола;

— пробы перемешивают на встряхивателе в течение 5 мин и помещают в охлаждаемую до –29±1 ^оС лабораторную установку для проведения ЭВЦ (ООО «Химбиомед», Сочи, Россия) [11] на 25 мин при скорости вращения ротора 4000 об/мин (фактор разделения 1650 g);

— в образующихся на поверхности льда экстрактах массой 0,1 г проводят ГХ-ТИД (N)-определение a-PVP;

— полученные результаты обрабатывают методом стандартной добавки.

Установленный процедурой добавки предел обнаружения α-PVP в моче при использовании разработанной методики составил 1 мкг/мл. На хроматограмме ЭВЦ-экстракта мочи с добавкой α-PVP видно, что определению препарата коэкстрактивные вещества не мешают (рис. 1).

Исследовали возможность использования метода внутреннего стандарта на основе дифениламина (ДФА) для количественного анализа. Оказалось, что он уступает по точности методу стандартной добавки определяемого вещества, поскольку незначительно, но меняется наклон линейной калибровочной зависимости, предварительно полученной на модельных смесях α-PVP и ДФА при проведении ЭВЦ. Полезно применение стандартной добавки ДФА в пробу для уверенной идентификации α-PVP по относительному приведенному времени удерживания (t_{отн.ДФА} = 1,4±0,04) и контроля качества пробоподготовки.

Предварительно, в модельных условиях установили, что рН проведения ЭВЦ влияет на степень концентрирования целевого компонента из мочи, снижая эффективность извлечения пировалерона при переходе в область рН 3,0 (табл. 1).

Кроме того, растут потери экстракта в объеме застывающей водной части пробы. Объяснение этому эффекту дал С.В. Нехорошев [14]. Как следует из сравнения хроматограмм на рис. 1—3, проведение экстракции в нейтральных и щелочных условиях при рН >6,0 заметно снижает уровень коэкстрактивных веществ в получаемом извлечении.

Косвенно из результатов определения степени концентрирования можно сделать вывод, что эффективность извлечения пировалерона из мочи высокая. Действительно, расчет показывал, что при экстракции из 9 мл мочи (водная замерзающая часть пробы) в незамерзающую органическую фазу (экстракт) общим объемом 1,75 мл степень его концентрирования С_орг/С_моча в органическом извлечении не должна превышать 5,14 (9/1,75). Полученные результаты (см. табл. 1) концентрирования пировалерона в экстрактах объяснимы с позиции его поверхностной активности в отношении границы раздела жидкость—воздух. Подобный эффект при ЭВ и ЭВЦ, который дополнительно увеличивает концентрирование, ранее установлен и для других аналитов [12].

Изучили также метрологические характеристики методики определения пировалерона в модельных условиях (табл. 2).

Как следует из данных табл. 2, предложенный метод имеет низкую погрешность определения α-PVP в моче. Это обусловлено одностадийной пробоподготовкой и отсутствием дополнительных манипуляций с пробой и экстрактом перед этапом газохроматографического исследования.

Метод газохроматографического определения α-PVP в моче с помощью экстракционного вымораживания в сочетании с центрифугированием обладает экспрессивностью. Он характеризуется минимальным количеством и доступностью реактивов, химической посуды (кроме пипеток, нужны только виалы), отсюда низкие себестоимость и затраты на реактивы. На исследование одной пробы мочи в качестве экстрагента расходуется 1,5 мл ацетонитрила, что в текущих ценах составляет около 1,5 руб., и 0,25 мл изоамилового спирта стоимостью менее 0,2 руб. Использование предложенного метода намного дешевле применения в пробоподготовке твердофазных сорбентов-патронов, в том числе по методу QuEChERS.

Сокращены время контакта и число операций с пробой: нет фильтрования, обезвоживания экстрактов, упаривания и пр. В результате относительная погрешность определения пировалерона не превышает 5%.

Улучшены условия труда, поскольку исследование проводят при низких температурах, существенно снижающих летучесть применяемых растворителей. Этап предварительной подготовки пробы длится не более 30 мин, поэтому нет необходимости в высококвалифицированном персонале. Все это позволяет рекомендовать метод для использования в химико-экспертной работе.

Достигнутые преимущества в пробоподготовке свидетельствуют о перспективах применения МЭВ в дальнейшем для оптимизации используемых и разрабатываемых методов химико-токсикологического и биохимического анализа, фармакологических исследований.

Важным результатом работы является также и то, что для идентификации и количественной оценки содержания пировалерона можно использовать отечественный газовый хроматограф с азотселективным термоионным детектором (ТИД-N), доступный для большинства судебно-химических лабораторий России. Активно предлагаемый в последнее время для идентификации аналитов метод ГХ-МС существенно уступает ему в стоимости и простоте технического обслуживания.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.