2-Хлор-1,4-дигидроксибензол, синонимы: хлоргидрохинон, монохлоргидрохинон, адурол-хлор (адурол Гауфа), хлорквинол, хлорхиноль (далее 2-Х-1,4-ДГОБ) - биологически активное соединение, обладающее свойствами фунгицида, антисептика и антиоксиданта. Является метаболитом 2,4-дихлорфеноксиуксуной кислоты (2,4-Д), одним из основных первичных продуктов фотоиндуцированного разложения 2,4-дихлорфенола, образуется при деградации ряда полихлорзамещенных бензола грибами вида Phanerochaete chrysosporium [1-4].

Известно применение 2-Х-1,4-ДГОБ в фотографии, в качестве полупродукта органических синтезов полимерных веществ и светочувствительных диазосоединений.

2-Х-1,4-ДГОБ (брутто-формула C₆H₅ClO₂, молярная масса 154,45 а.е.м.) представляет собой бесцветные иглы или бесцветный порошок с температурой плавления 103-104 °С (по другим источникам 101-102 °С) и температурой кипения 263 °C; рК_а соединения 9,09. Легко растворимо в воде, этаноле, диэтиловом эфире, при нагревании - в бензоле и трихлорметане [5].

2-Х-1,4-ДГОБ, как и многие другие галогенпроизводные дигидроксиаренов и ароматических кислот, обладает выраженными токсическими свойствами по отношению к теплокровным организмам. Для морских свинок LD₅₀ при перкутанном введении составляет 500 мг/кг, LDL_o для крыс при пероральном введении 200 мг/кг, при интраперитонеальном - 100 мг/кг, при перкутанном - 500 мг/кг [6-9].

Описаны отравления людей веществами из группы дигидроксипроизводных бензола, к которым относится и 2-Х-1,4-ДГОБ [10, 11]. Это определяет интерес к 2-Х-1,4-ДГОБ как к потенциальному объекту химико-токсикологического анализа. Несмотря на важное химико-токсикологическое значение 2-Х-1,4-ДГОБ, многие вопросы судебно-химического анализа данного соединения разработаны недостаточно.

Цель исследования - изучение особенностей определения 2-Х-1,4-ДГОБ в тканях трупных органов и крови.

Исследовали 2-Х-1,4-ДГОБ фирмы «Acros» с содержанием основного вещества 99% и более (определено методом ГЖХ).

Провели сравнительное изучение изолирования 2-Х-1,4-ДГОБ из биологического материала путем настаивания с растворителями различной химической природы: водой, водными растворами различной реакции, а также органическими веществами, относящимся к группам алканов, галогеналканов, алканолов, нитрилов, кетонов, аренов, гетероциклических кислородсодержащих соединений, алифатических карбоновых кислот и их алкиловых эфиров, диалкиламидов карбоновых кислот.

Предварительно готовили модельные смеси исследуемого вещества (размер частиц 5-50 мкм) с мелкоизмельченной (размер частиц 0,2-0,5 мм) тканью трупной печени, которые содержали 25 мг 2-Х-1,4-ДГОБ в 25 г биоматериала. Затем смеси выдерживали в течение часа при температуре 18-20 °С.

Осуществляли двукратное изолирование 2-Х-1,4-ДГОБ из модельных смесей при соотношении изолирующего агента и биологического материала 2:1 (по массе). Продолжительность каждого настаивания составляла 60 мин. Оба извлечения, полученные из каждой модельной смеси, объединяли, фильтровали через бумажный фильтр, предварительно смоченный изолирующим агентом. Часть фильтрата очищали от соэкстрактивных веществ биоматериала методом адсорбционной высокоэффективной ТСХ в тонком слое гидроксилированного сорбента СТХ-1А (пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ), используя подвижную фазу гексан-этанол (6:4 по объему). При облучении получаемых хроматограмм УФ-лучами 2-Х-1,4-ДГОБ проявлялся на них в виде темного пятна с Rf = 0,46±0,03. Рассматриваемое соединение элюировали из сорбента 5 мл этанола.

Количественное содержание 2-Х-1,4-ДГОБ в извлечениях определяли методом УФ-спектрофотометрии по интенсивности поглощения этанольного элюата при аналитической длине волны 300 нм. Расчеты осуществляли с помощью градуировочного графика.

По приведенной схеме изолирования, очистки и определения 2-Х-1,4-ДГОБ исследовали зависимость степени извлечения данного вещества из биологического материала оптимальным изолирующим агентом от продолжительности контакта изолирующей жидкости с биоматериалом, кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и биологического объекта.

В найденных оптимальных условиях изолирования определяли зависимость степени извлечения 2-Х-1,4-ДГОБ от концентрации анализируемого соединения в биологической матрице. Использовали модельные смеси, которые готовили путем добавления к постоянной массе (25 г) мелкоизмельченной ткани печени различного количества (от 1,25 до 50 мг) 2-Х-1,4-ДГОБ.

Изучали особенности очистки 2-Х-1,4-ДГОБ, выделенного из биоматериала, методом колоночной хроматографии (колонка размером 490×11 мм, заполненная 7,5 г сорбента Силасорб С-18 с размером частиц 30 мкм); элюент - система растворителей ацетонитрил-вода (6:4). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. Обнаруживали 2-Х-1,4-ДГОБ во фракциях методом ТСХ (пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ, подвижная фаза гексан-этанол (6:4), объем фракции, наносимый на пластину 5-10 мкл).

Параллельно осуществляли контрольное хроматографирование на колонке извлечения из 25 г трупной печени. Фракции элюата, в которых теоретически возможно присутствие анализируемого вещества, объединяли, испаряли и растворяли остаток в 25 мл этанола, а затем и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 300 нм.

Для предварительной идентификации 2-Х-1,4-ДГОБ изучали возможность применения нормальнофазового варианта ТСХ. Вещество хроматографировали вместе с близкими по структуре соединениями на пластинах Сорбфил ПТСХ-АФ-В-УФ.

Для подтверждающей идентификации 2-Х-1,4-ДГОБ использовали УФ-спектрофотометрию и ГХ-МС; УФ-спектрофотометрию применяли также для оценки количественного содержания рассматриваемого вещества в биоматериале.

При определении 2-Х-1,4-ДГОБ с помощью ГХ-МС использовали хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6850 Network GC System с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973 Network. Хроматографировали в кварцевой капиллярной колонке DB-5 ms EVIDEX (30 м×0,25 мм) с неподвижной фазой диметилполисилоксаном (толщина пленки фазы 0,33 мкм). Детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Вещество обнаруживали в режиме регистрации по полному ионному току (диапазон сканирования 40-550 m/z) с задержкой на растворитель 3,5 мин.

Относительная ошибка среднего результата при определении 2-Х-1,4-ДГОБ методом УФ-спектрофотометрии в субстанции 0,94% и менее (n=6; p=0,95).

Результаты сравнительного изучения изолирования 2-Х-1,4-ДГОБ из биологического материала 15 различными изолирующими жидкостями представлены на рис. 1.

Наибольшая степень извлечения рассматриваемого соединения достигается при настаивании модельных смесей с ацетоном.

Установили, что для относительно полного извлечения вещества из биоматериала (ткань печени) ацетоном достаточно двукратного настаивания биоматериала с изолирующим агентом при условии, что количество изолирующей жидкости в каждом случае превышает количество биоматериала как минимум в 2 раза по массе (табл. 1). Продолжительность каждого настаивания должна составлять не менее 60 мин.

При хроматографировании в колонке с сорбентом Силасорб С-18 с размером частиц 30 мкм и применением подвижной фазы ацетонитрил-вода (6:4) анализируемое вещество обнаруживается во фракциях № 4-6 (7-12 мл).

В опытах с тканью печени, не содержащей 2-Х-1,4-ДГОБ, установили, что фоновое поглощение раствора ¼ сухого остатка фракций, в которых возможно присутствие данного вещества, в смеси ацетонитрил-вода (6:4) незначительно и не превышает 0,013 при l300 нм.

Результаты исследования хроматографической подвижности 2-Х-1,4-ДГОБ, а в тонких слоях сорбентов представлены в табл. 2.

Как видно из данных табл. 2, оптимальными для хроматографирования данного вещества в тонком слое нормальнофазового сорбента следует считать подвижные фазы гексан-диоксан-пропанол-2 (40:5:1), гексан-пропанол-2 (9:1), гексан-этанол (6:4). В дальнейшем в исследованиях применяли подвижную фазу гексан-этанол (6:4).

В качестве растворяющей среды для определения 2-Х-1,4-ДГОБ методом УФ-спектрофотометрии выбрали этанол. В спектре 2-Х-1,4-ДГОБ в среде этанола присутствуют две выраженные полосы поглощения с максимумами в области 208 нм (ε=12860) и 300 нм (ε=4486).

Для количественного определения 2-Х-1,4-ДГОБ методом УФ-спектрофотометрии строили градуировочный график и рассчитывали уравнение: А = 0,025532·C-0,005485, где А - оптическая плотность; С - концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). График линеен в интервале концентраций 2,5–60,0 мкг/мл. Коэффициент корреляции более 0,99.

Для определения 2-Х-1,4-ДГОБ методом ГХ-МС предложены условия, при которых температура инжектора 250 ^оС, температура интерфейса детектора 300 ^оС, начальная температура термостата колонки 70 ^оС, время при начальной температуре 5 мин, скорость нагрева термостата колонки 20 ^оС/мин, конечная температура термостата 290 ^оС. Газ-носитель - гелий, скорость газа-носителя 0,6 мл/мин, объем вводимой пробы 4 мкл. Пробу вводили c делением потока 1:2. В данных условиях на хроматограммах наблюдали пик (время удерживания 9,85±0,16 мин), соответствующий 2-Х-1,4-ДГОБ (рис. 2). Масс-спектр вещества, соответствующий этому пику, включал сигналы ряда осколков (заряженные частицы) с характерными массами: 52 (47,6%) m/z, 66 (8,5%), 80 (35,4%), 99 (2,4%), 115 (11,51%), 144 (100%). Основным, масса которого принимается за 100%, являлся осколок с массой 144 m/z (рис. 3).

Подобное сочетание сигналов характерных осколков вещества с временем удерживания позволяет с высокой селективностью идентифицировать анализируемое вещество с помощью ГХ-МС. Открываемый минимум 2-Х-1,4-ДГОБ составляет при этом 5,0·10^–8 г в хроматографируемой пробе.

Изолирование. 25 г биологического объекта, содержащего 2-Х-1,4-ДГОБ, настаивали дважды по 1 ч порциями ацетона массой 50 г каждая при перемешивании. Объединенное извлечение пропускали через стеклянный фильтр диаметром 4 см со слоем безводного сульфата натрия толщиной 1,5-2,0 см, слой сульфата натрия промывали 20 мл изолирующего агента. Фильтраты объединяли, растворитель из объединенного фильтрата испаряли при комнатной температуре. Остаток растворяли в 2,0-2,5 мл смеси ацетонитрил-вода (6:4) и вводили полученный раствор в хроматографическую колонку размером 490×10  мм, заполненную 7,5 г неподвижной фазы Силасорб С-18 30 мкм. Хроматографировали, используя элюент ацетонитрил-вода (6:4). Элюат собирали фракциями по 2 мл. Фракции с 7-й по 12-ю включительно объединяли, испаряли в токе воздуха при температуре 20-22 °С. Остаток растворяли в 10 мл ацетона. В две выпарительные чашки (№ 1, № 2) вносили соответственно 0,1-5,0 и 1,0-4,0 мл ацетонового раствора и испаряли растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяли в незначительном объеме ацетона и количественно наносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил UV-254. Хроматографировали, применяя систему растворителей гексан-этанол (6:4) в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы детектировали в УФ-лучах и идентифицировали анализируемое вещество по величине Rf, совпадающей с таковой вещества-свидетеля (0,46±0,03).

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ пятно вещества вырезали из хроматограммы, помещали в пробирку, элюировали вещество из сорбента 95% этанолом 15 мин и исследовали поглощение элюата в интервале длин волн 190-360 нм. Соединение идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения (208±2 и 300±1 нм).

Идентификация методом ГХ-МС. Остаток в чашке № 2 растворяли в 8-12 мл хлороформа, раствор переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки хлороформом. Затем 4 мкл полученного раствора вводили в хроматограф типа Agilent Technologies (США) модели 6850N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N («Agilent Technologies») и хроматографировали в указанных ранее условиях.

Изолированный из биологических объектов 2-Х-1,4-ДГОБ идентифицировали по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки (см. рис. 2) и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре (см. рис. 3).

Количественное определение. Определяли количественное содержание анализируемого соединения методом УФ-спектрофотометрии по интенсивности поглощения этанольного элюата при l300 нм, используя уравне-ние градуировочного графика, и пересчитывали на навеску анализируемого вещества, внесенную в биоматериал (табл. 3).

Разработанная методика характеризуется высокой степенью извлечения 2-Х-1,4-ДГОБ из биологических тканей и крови (более 84%) при концентрации анализируемого вещества в биоматериале 0,005-0,2%.

Удается извлечь из модельных смесей с тканью печени 85,43-96,26%, с тканью гнилостно-измененной печени 84,56-95,39%, с кровью 84,02-91,04% соединения.

Открываемый минимум 2-Х-1,4-ДГОБ составляет в ткани печени, ткани гнилостно-измененной печени и крови соответственно 0,26, 0,30 и 0,22 мг в 100 г биологического объекта.

1. Показана возможность и определены оптимальные условия изолирования 2-хлор-1,4-дигидроксибензола из биологического материала ацетоном.

2. Разработана методика определения 2-хлор-1,4-дигидроксибензола в тканях органов и крови на основе изолирования данным растворителем и очистки в колонке сорбента Силасорб С-18 30 мкм.

3. Для идентификации и определения количества исследуемого вещества в биологических объектах предложены ТСХ, ГХ-МС и УФ-спектрофотометрия.

4. Разработанная методика валидирована по показателям линейности правильности, прецизионности и открываемого минимума.

Конфликт интересов отсутствует.