4-Нитро-3-(трифторметил)-анилин (далее 4-Н-3-ТФМА) — это ярко-желтые кристаллы без запаха, плохо растворимые в воде, гексане, растворах щелочей и кислот, хорошо растворимые в этаноле, ацетоне, ацетонитриле, диметилформамиде, диоксане и этилацетате.

4-Н-3-ТФМА представляет собой продукт кислотного гидролиза флутамида и при нарушении правил хранения последнего может накапливаться в нем в виде примеси. В соответствии со структурными особенностями 4-Н-3-ТФМА является вероятным цитостатиком [1—4].

Рассматриваемое соединение относится к производным 4-нитроанилина и поэтому оказывает токсическое действие на теплокровные организмы. Его LD50 составляет для крыс при внутрижелудочном введении около 1500 мг/кг. Известны случаи различной степени тяжести отравления 4-нитроанилином и его производными людей, в том числе с летальным исходом [5, 6]. Вследствие этого 4-Н-3-ТФМА можно считать потенциальным объектом химико-токсикологического исследования.

Цель исследования — изучение особенностей определения 4-Н-3-ТФМА в биологическом материале.

Исследовали 4-Н-3-ТФМА с содержанием вещества не менее 99% (определено методом нитритометрии по методике ГФ XI).

Изучали особенности изолирования 4-Н-3-ТФМА из биологического материала растворителями различной химической природы: водой и водными растворами (0,1 н раствор хлороводородной кислоты, 8% раствор уксусной кислоты), карбоновыми кислотами (ледяная уксусная кислота), алкилзамещенными амидами кислот (ДМФА), кетонами (ацетон), спиртами (этанол, пропанол-1, пропанол-2, бутанол), гетероциклическими кислородсодержащими соединениями (диоксан), алканами (гексан), галогеналканами (хлороформ, четыреххлористый углерод), аренами (бензол, толуол), сложными и простыми эфирами (диэтиловый эфир, метилацетат, этилацетат, пропилацетат, бутилацетат), нитрилами (ацетонитрил).

Готовили модельные смеси исследуемого вещества (размер частиц 5—50 мкм) и мелкоизмельченной (размер частиц 0,2—0,5 мм) трупной печени с содержанием 25 мг вещества в 25 г биоматериала, которые после приготовления выдерживали при температуре 18—20 °С в течение 1,5  ч [7]. Осуществляли двукратное изолирование 4-Н-3-ТФМА из модельных смесей при соотношении изолирующего агента и биологического материала 2:1 (по массе). Продолжительность каждого настаивания составляла 60  мин. Оба извлечения, полученные из каждой модельной смеси, объединяли, фильтровали через бумажный фильтр, предварительно смоченный изолирующим агентом, а затем очищали от соэкстрактивных веществ биологической матрицы методом адсорбционной высокоэффективной ТСХ, используя тонкий слой гидроксилированного сорбента СТХ-1А (пластины Sorbfil ПТСХ-АФ-В-УФ) и подвижную фазу гексан—ацетон в объемных соотношениях 7:3. На хроматограммах 4-Н-3-ТФМА обнаруживался в виде желтого пятна с Rf=0,46±0,03 в видимом свете или в виде темного пятна на более светлом общем фоне пластины при воздействии УФ-света. 4-Н-3-ТФМА элюировали из сорбента 5 мл этанола.

Количество 4-Н-3-ТФМА в извлечениях определяли методом электронной спектрофотометрии по интенсивности поглощения этанольного элюата при аналитической длине волны 373 нм. Расчеты осуществляли по уравнению градуировочного графика (коэффициент корреляции более 0,99): А=0,03585·C–0,00475, где А — оптическая плотность; С — концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). График линеен в интервале концентраций 1—40 мкг/мл.

С помощью описанной схемы изолирования, очистки и определения 4-Н-3-ТФМА исследовали зависимость степени извлечения рассматриваемого вещества из биологического материала оптимальным изолирующим агентом от продолжительности контакта изолирующей жидкости с биологическим материалом, кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и биологической ткани.

В найденных оптимальных условиях изолирования изучали зависимость степени извлечения 4-Н-3-ТФМА от концентрации анализируемого соединения в биологическом объекте. Использовали модельные смеси, которые готовили путем прибавления к постоянной массе (25 г) мелкоизмельченной ткани печени различного количества 4-Н-3-ТФМА (от 1,25 до 50 мг).

Изучали особенности очистки 4-Н-3-ТФМА, выделенного из биоматериала, методом колоночной хроматографии (колонка размером 490×11 мм, заполненная 10 г сорбента силикагеля L 40/100 мкм; элюент — система растворителей гексан—ацетон 8:2). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. 4-Н-3-ТФМА обнаруживали во фракциях методом ТСХ (пластины Сорбфил UV-254, подвижная фаза — гексан—ацетон 7:3, объем фракции, наносимый на пластину, 5—10 мкл).

Параллельно осуществляли контрольное хроматографирование на колонке извлечения из 25 г трупной печени. Фракции элюата, в которых теоретически возможно присутствие анализируемого вещества, объединяли, испаряли и растворяли остаток в 10 мл ацетона. Затем 4 мл полученного раствора вносили в выпарительную чашку и испаряли растворитель в токе воздуха. Остаток растворяли в 25 мл этанола и измеряли оптическую плотность раствора при длине волны 373 нм (условия определения 4-Н-3-ТФМА методом спектрофотометрии).

Предварительная идентификация осуществлялась методом ТСХ.

Для подтверждающей идентификации 4-Н-3-ТФМА использовали методы электронной спектрофотометрии и ГХ—МС.

С помощью ГХ—МС определение проводили на приборе Agilent Technologies 7890 В с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5977А, работающим в режиме электронного удара (70 эВ). Сигналы регистрировали по полному ионному току в диапазоне 45—550 m/z.

Результаты изолирования 4-Н-3-ТФМА из трупной печени различными растворителями представлены на рис. 1. Сравнение результатов показало, что наибольшая степень извлечения достигается при использовании в качестве изолирующего агента ацетона.

Установлено, что максимальная степень извлечения 4-Н-3-ТФМА из тканей трупной печени и биожидкостей (кровь, плазма, моча) ацетоном достигается уже при продолжительности настаивания 30 мин (рис. 2).

Исследовали также зависимость степени извлечения 4-Н-3-ТФМА от кратности настаивания и количественного соотношения изолирующего агента и биоматериала (табл. 1). Оказалось, что для достаточно полного извлечения данного соединения необходимо двукратное настаивание биологического материала с изолирующим агентом при условии, что количество ацетона в каждом случае должно превышать количество биологического материала как минимум в 2 раза по массе.

Как свидетельствуют данные эксперимента (табл. 2), увеличение содержания 4-Н-3-ТФМА в модельных смесях с тканью печени в концентрации 1,25—50 мг при постоянной массе навески биоматериала (25 г) сопровождается изменением значений степени извлечения, не превышающим 3,5%. Это позволяет предположить, что взаимодействие молекул 4-Н-3-ТФМА со структурными элементами биологических тканей не приводит к образованию достаточно прочных связей.

При хроматографировании на колонке силикагеля L 40/100 мкм с применением подвижной фазы гексан—ацетон (8:2) анализируемое вещество обнаруживается во фракциях с 10 по 26 включительно (19—52 мл).

В опытах с тканью печени, не содержащей 4-Н-3-ТФМА, установили, что фоновое поглощение раствора сухого остатка фракций, в которых возможно присутствие данного вещества, в этаноле незначительно и не превышает 0,009—0,013 при длине волны 373 нм.

При исследовании методом ГХ—МС применяли капиллярную колонку HP-5MS (30 м×0,2 мм) с неподвижной фазой (5% фенил)-метилполисилоксан (толщина слоя 0,25 мкм). Газ-носитель — гелий, скорость его подачи 1 мл/мин; температура инжектора 250 °C, интерфейса детектора — 290 °C. Начальная температура термостата колонки 70 °C, она выдерживалась 2 мин, затем температуру повышали со скоростью 40 °C в 1 мин до 200 °C с последующим нагревом со скоростью от 12,5 до 290 °C. Деление потока в инжекторе в соотношении 5:1. Объем вводимой пробы 4 мкл.

В данных условиях на хроматограммах наблюдали пик (время удерживания 6,75 мин), соответствующий 4-Н-3-ТФМА (рис. 3, а).

Масс-спектр, соответствующий пику с временем удерживания 6,75 мин (см. рис. 3, б), включал сигналы ряда осколков (заряженные частицы) с характерными массами: 41, 62, 63, 75, 83, 91, 101, 113, 128, 140, 148, 160, 168, 176, 190, 206 m/z. Основным, масса которого принимается за 100%, являлся осколок массой 206 m/z. Данный осколок одновременно был и молекулярным ионом. Подобное сочетание сигналов характерных осколков вещества с временем удерживания позволяет с высокой селективностью идентифицировать анализируемое вещество с помощью ГХ—М.С. Открываемый минимум 4-Н-3-ТФМА составляет при этом соответственно 1·10^–9 г в хроматографируемой пробе.

На основе результатов предварительных исследований предложена методика определения 4-Н-3-ТФМА в биологическом материале.

Методика определения 4-Н-3-ТФМА в биологических объектах. Изолирование из тканей органов. 25 г мелкоизмельченной трупной печени, содержащей определенное количество 4-Н-3-ТФМА (от 1,25 до 50 мг), заливают 50  мл ацетона и выдерживают в течение 30 мин, периодически перемешивая. Извлечение сливают, а процесс настаивания повторяют по описанной ранее схеме. Оба извлечения объединяют в выпарительной чашке. Объединенное извлечение упаривают до сухого остатка в токе воздуха при температуре 18—20 °С.

Изолирование из крови и плазмы. 25 г биологической жидкости, содержащей определенное количество 4-Н-3-ТФМА (от 1,25 до 50 мг), заливают 50 мл ацетона и выдерживают 30 мин, периодически перемешивая. Жидкое извлечение отделяют от твердого остатка фильтрованием через бумажный фильтр. Операцию настаивания повторяют в описанных условиях. Фильтр и остаток на фильтре промывают 20 мл ацетона. Отдельные фильтраты объединяют и далее поступают так же, как при изолировании из ткани трупного органа.

Изолирование из мочи. 25 г биологической жидкости, содержащей определенное количество 4-Н-3-ТФМА (от 1,25 до 50 мг), заливают 50 г ацетона и выдерживают 30  мин, периодически перемешивая. Жидкое извлечение отделяют от твердого остатка фильтрованием через бумажный фильтр. Фильтр и остаток на фильтре промывают 20 мл ацетона. Отдельные фильтраты объединяют и далее поступают так же, как при изолировании из ткани трупного органа.

Очистка методом адсорбционной колоночной хроматографии. Сухой остаток, полученный после упаривания объединенного извлечения, растворяют в 2—3 мл ацетона, смешивают полученный раствор с 1,5 г силикагеля L 40/100 мкм и после испарения растворителя вносят данную смесь в стеклянную хроматографическую колонку размером 490×11 мм, предварительно заполненную 8,5 г силикагеля L 40/100 мкм. Содержимое колонки уплотняют путем равномерного постукивания по внешней поверхности ее стенок. Хроматографируют, используя элюент гексан—ацетон (8:2). Элюат собирают фракциями по 2 мл каждая. Фракции с 10-й по 26-ю включительно объединяют, испаряют в токе воздуха при температуре 18—20 °С. Остаток растворяют в 6—8 мл ацетона, раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводят ацетоном до метки («исходный ацетоновый раствор»).

По 0,5—4,0 мл полученного раствора вносят в две выпарительные чашки (№ 1 и № 2) и испаряют растворитель.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке № 1 растворяют в небольшом (0,4—0,6 мл) объеме ацетона и количественно переносят на хроматографические пластины Сорбфил с люминесцентным индикатором в виде полосы и хроматографируют в присутствии вещества-свидетеля в стеклянной камере, используя в качестве элюента систему растворителей гексан—ацетон (7:3). Анализируемое вещество идентифицируют по величине Rf (0,46±0,03).

Идентификация методом ГХ—МС. Остаток в чашке № 2 растворяют в 4 мл дихлорметана. При необходимости (в случае присутствия больших количеств анализируемого вещества) раствор разбавляют дихлорметаном. 4 мкл полученного раствора вводят в газовый хроматограф Agilent Technologies 7890 В с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5977А и хроматографируют в описанных ранее условиях.

Анализируемое соединение идентифицируют по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

Идентификация и количественное определение методом электронной спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ по указанной схеме участок хроматограммы с анализируемым веществом вырезают и элюируют вещество 5—10 мл этанола. Оптическую плотность элюата измеряют при длине волны 373 нм на спектрофотометре СФ-2000 в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм на фоне контрольного элюата. Соединение идентифицируют по форме спектральной кривой и положению максимума поглощения (373 нм). Количественное содержание рассматриваемого вещества рассчитывают по уравнению градуировочного графика.

Результаты количественного определения 4-Н-3-ТФМА в ткани трупной печени и биожидкостях представлены в табл. 3 и 4.

Как свидетельствуют полученные данные, при содержании анализируемого вещества в количестве 1,25—50 мг в 25 г биологического объекта разработанная методика позволяет определять в ткани печени 87,83—90,52%, в крови — 84,89—85,81%, в плазме — 90,07—91,21%, в моче — 93,60—94,17% данного соединения с полушириной доверительного интервала 4,18—5,13; 3,13—4,17; 1,89—2,63 и 1,92—2,51% соответственно.

Определяемый минимум данной методики (в 100 г биологического объекта) составляет 0,12 мг вещества в печени; 0,09 мг — в крови; 0,06 мг — в плазме и 0,04 мг — в моче.

Проведена валидационная оценка предложенной методики, показавшая ее достаточную чувствительность и воспроизводимость. Методика отличается необходимой правильностью и может быть использована при проведении экспертизы в случае отравления 4-Н-3-ТФМА.

1. Показана возможность и определены оптимальные условия изолирования 4-нитро-3-(трифторметил)-анилина из биологического материала ацетоном.

2. Разработана методика определения 4-нитро-3-(трифторметил)-анилина в тканях трупных органов и биожидкостях на основе изолирования данным растворителем и очистки в колонке силикагеля L 40/100 мкм.

3. Для идентификации и оценки количественного содержания исследуемого вещества в биологических объектах предложены методы ТСХ, электронной спектрофотометрии и ГХ—МС.

Конфликт интересов отсутствует.