В последние годы для лечения психически больных широко применяются лекарственные препараты, относящиеся к группе атипичных нейролептиков (атипичные антипсихотики). К числу таких лекарственных средств относят кветиапин, оланзапин, рисперидон и др.
Кветиапин (сероквель, н-кетилепт, квентиакс) по химической структуре относится к производным дибензотиазепина, оланзапин (зипрекса) является производным тиено-бензодиазепина (конденсированная система, содержащая бензодиазепиновый и метилтиофеновый циклы).
Кветиапин и оланзапин, являясь атипичными нейролептиками, по механизму фармакологического действия входят в группу препаратов, которые характеризуются взаимодействием с несколькими различными нейромедиаторными системами: дофаминовыми, серотониновыми, норадренергическими, холинергическими и гистаминовыми рецепторами [1].
Препараты широко применяются при шизофрении и других психозах [2]. Некоторые исследователи [3-7] считают, что указанные препараты более эффективны и гораздо лучше переносятся, чем типичные нейролептики. Клинические материалы последних лет свидетельствуют о том, что атипичные нейролептики не обладают существенным превосходством над типичными, как и последние, вызывают ряд побочных эффектов: неврологические (ажитация, злокачественный нейролептический синдром), метаболические и эндокринные побочные явления, гиперпролактинемия, удлинение интервала QT на ЭКГ, что связано с повышенным риском возникновения полиморфной желудочковой тахикардии и внезапной сердечной смерти, ортостатические коллапсы, увеличение массы тела, что снижает качество жизни больного, приводит к стигматизации, повышает риск соматических заболеваний, появление сахарного диабета 1-го и 2-го типов. В 2005 г. Food and Drug Administration сделано предупреждение, что атипичные нейролептики повышают риск смерти пожилых людей на 60-70%. За 180 дней, на протяжении которых регистрировали смертельные исходы, умерли 20% пациентов, получавших указанные препараты [8].
Клинические симптомы и патоморфологическая картина при отравлениях кветиапином и оланзапином нехарактерны. В связи с этим их определение в биологических объектах является решающим в диагностике смертельных и несмертельных отравлений.
Описан случай смертельного отравления кветиапином и приведены способы его определения в тканях внутренних органов трупа [9]. Изолирование его из тканей желудка, печени, почки и тонкой кишки проводили этанолом и водой, подкисленными щавелевой кислотой, а также путем гидролиза. Хлороформные экстракты хроматографировали на пластинах Сорбфил в трех системах растворителей, детектировали пятна с помощью реактива Драгендорфа, модифицированного по Мунье, - оранжевое окрашивание, 5% раствором сульфата ртути в серной кислоте и 0,02% раствором дифенилкарбазона в хлороформе - сине-фиолетовое и смесью 1% растворов сульфата меди и феррицианида калия (1:1) - коричневое окрашивание. Методом газожидкостной хроматографии (ГЖХ) определяли время удерживания кветиапина и его ацетильного производного; при спектрофотометрировании в 0,1 н. растворе соляной кислоты максимум абсорбции кветиапина наблюдали при длине волны 290 нм.
Описан случай смертельного отравления мужчины кветиапином при передозировке [10]. В результате проведенного исследования в сыворотке крови обнаружили 18,3 нг/мл, в содержимом желудка - 10,8 мг кветиапина.
А.А. Мельник и соавт. [11] представили результаты экспериментов по определению кветиапина, его производных и метаболитов в биологических образцах методами ГХ-МС и ВЭЖХ. Они использовали газовый хроматограф 6890 с масс-спектрометрическим квадрупольным детектором 5975VL («Agilent Technologies»). Хроматограммы получали с помощью двух кварцевых капиллярных колонок слабой и средней полярности, для каждой из которых применяли «быстрый» и «медленный» температурные режимы. ВЭЖХ-измерения выполняли с помощью модульной системы 1200 («Agilent Technologies») с бинарным насосом G1312A и диодно-матричным детектором G1315B в градиентном режиме. Ацетильные и триметилсилильные производные получали по стандартным методикам. Авторы считают, что ГЖХ-методики позволяют получать приемлемые результаты для определения кветиапина и его метаболитов; метод ВЭЖХ-ДМД количественного определения кветиапина может быть использован в качестве вспомогательного при уверенности в наличии и значительном содержании кветиапина в образце.
Применение хроматографических методов (ТСХ и ВЭЖХ) для обнаружения и количественного определения кветиапина в моче описали Д.С. Лазарян и соавт. [12]. Изолирование кветиапина из мочи (модельные опыты) проводили с помощью жидкость-жидкостной экстракции в экстракционных пробирках системы Toxi-Lab. Спиртовые растворы экстрактов исследовали методом ТСХ на пластинах Сорбфил параллельно со стандартным раствором кветиапина в системах растворителей различной полярности. Обнаруживали пятна кветиапина на хроматограммах с помощью реактива Драгендорфа (желто-оранжевые пятна), предел обнаружения - 6 мкг кветиапина в пробе. Для выявления и количественного определения кветиапина авторы использовали метод ВЭЖХ: хроматограф Милихром А02, колонка с сорбентом Prontosil 120-5C AQ, элюенты - 2% раствор муравьиной кислоты и ацетонитрил, режим градиентный, длина волны 280 нм, время удерживания 10,86 мин, количество выделенного кветиапина составило 40,1±5,3%.
Т.Х. Вергейчик и соавт. [13-15] представили результаты экспериментов по изолированию, обнаружению и определению кветиапина при исследовании биологических объектов. Изолирование кветиапина из трупной печени и почек проводили по методу А.А. Васильевой с последующей экстракцией из водных растворов хлороформом при рН 2 и 10. Экстракты из печени анализировали с помощью ВЭЖХ: в кислых экстрактах найдено около 1%, в щелочных - 59% кветиапина. Для анализа щелочных экстрактов из почек использовали УФ-спектрофотометрию, ТСХ и ВЭЖХ. При исследовании экстрактов методом УФ-спектрофотометрии авторы констатировали отсутствие характерных четких максимумов на кривой абсорбции кветиапина. Методом ВЭЖХ было найдено около 43% кветиапина. Изолирование кветиапина из крови осуществляли путем двухразовой экстракции смесью хлороформ-этанол (1:1) в присутствии сульфата аммония. Кветиапин в экстрактах обнаруживали с помощью ТСХ, ВЭЖХ и ГЖХ, для количественного анализа применяли ВЭЖХ [12]: время удерживания кветиапина 11,22 мин, выход - 72,44%.
Описан случай смертельного отравления 27-летней женщины после приема 30 г кветиапина [16]. В день поступления в сыворотке крови определили 8,67 мг/л препарата, а после смерти - 3,28 мг/л, т.е. концентрации кветиапина превышали терапевтические (более 1 мг/л).
Исследовали 21 посмертный биологический образец с применением жидкость-жидкостной экстракции и ВЭЖХ [17]. Анализу были подвергнуты кровь, печень, стекловидное тело и содержимое желудка. Авторы считают, что концентрация кветиапина более 1 мг/л в крови, 0,5 мг/л в стекловидном теле и более 5 мг/кг в печени могут рассматриваться как токсичные концентрации.
Авторы [18] изучали распределение кветиапина в тканях 20 смертных случаев. После твердофазной экстракции получали триметилсилильное производное кветиапина и проводили количественное определение с помощью ГЖХ в сочетании с масс-спектрометрией. Предел определения кветиапина 0,1 мг/л. В периферической крови обнаружено 7,7 мг/л, в крови сердца - 23,63 мг/мл, в печени - 91 мг/кг, в желчи - 44 мг/л, в моче - 15 мг/л, в желудке - 897 мг, в стекловидном теле - 1,4 мг/л. Смертельная концентрация кветиапина в крови, по мнению авторов, составляет 7,95 мг/л.
Изучали распределение кветиапина в биологических посмертных образцах [19]. Описано 13 случаев. Проводили жидкость-жидкостную экстракцию, идентифицировали с помощью капиллярной газовой хроматографии с азотно-фосфорным детектором. Кроме того, использовали сочетание газовой хроматографии и масс-спектрометрии. Определили концентрацию кветиапина в крови 0,07-18,37 мг/л (n=12); в крови бедренной артерии 0,06-19,25 мг/л (n=10). В 3 случаях токсичная концентрация кветиапина составила 0,72-18,37 мг/л.
С помощью ВЭЖХ с хемилюминесцентным детектированием для определения кветиапина с трис (2,2’-бипиридил) рутением (II) в моче и сыворотке крови обнаружили кветиапина 3·10–6 и 7·10–7 моль/л соответственно [20].
Описан анализ амитриптилина, флуоксетина, кветиапина и сертралина с использованием высушенных пятен плазмы [21]: 15 мкл плазмы наносят на бумагу и сушат в течение 2 ч. Часть пятна (2-4 мм) отрезают, десорбируют с помощью растворителя и анализируют методом ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Флуоксетин-d6- используют в качестве внутреннего стандарта. При добавлении 5 нг/мл выход кветиапина составил 98%, при добавлении 500 нг/мл - 94%.
Авторы [22] привели методику раздельного определения кветиапина и трех его метаболитов в плазме пациентов методом ВЭЖХ с масс-селективным детектированием и электроспреем в качестве источника ионизации (HPLC-MS/ESI). Исследуемые вещества выделяли из подщелоченной плазмы 5 больных шизофренией путем твердофазной экстракции, разделяли с помощью ВЭЖХ, используя колонки с сорбентом Kromasil C
Описан чувствительный и селективный метод ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией (LS-MS-MS) для определения кветиапина в плазме человека. Исследование выполнено на квадрупольном масс-спектрометре с позитивной ионизацией электрораспылением. Для анализа использовали 0,1 мл плазмы, в качестве внутреннего стандарта - клозапин. Линейную зависимость наблюдали в диапазоне 1-1500 нг/мл, точность определения - до 10,2%, отклонение в результатах определений - менее 7,44%, предел определения - 1 нг/мл. Выход кветиапина после экстракции составил более 90% [23].
Авторы [24] определяли кветиапин фумарата в сыворотке крови человека с помощью ВЭЖХ. Подвижная фаза метанол-вода-ацетат аммония-гидроксид аммония (400:100:5:1), рН 9,7, колонка С18, длина волны 254 нм. Расчет проводили по стандарту, линейная зависимость наблюдалась в диапазоне 10-300 мкг/л, предел обнаружения кветиапина фумарата 5 мкг/л.
Для выделения кветиапина из плазмы использовали твердофазную экстракцию после подщелачивания до рН 11,8, для определения кветиапина - валидизированный метод ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией [25]. Подвижная фаза - ацетонитрил-метанол-0,01М ацетат аммония (31:19:50), колонка С18, внутренний стандарт - клозапин, предел определения кветиапина - 1 нг/мл.
Кветиапин является неустойчивым соединением и в организме подвергается интенсивной биотрансформации. В связи с этим нативное вещество в биологических объектах может быть не обнаружено. В данном случае определение метаболитов кветиапина может служить косвенным доказательством отравления кветиапином.
Авторы [26] в экспериментах in vitro при участии фермента цитохрома Р-450 получили ряд метаболитов кветиапина. С помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии обнаружили пики возможных метаболитов - N-дезалкилкветиапина, N-дезалкилкветиапина сульфоксида, 7-гидрокси-N-дезалкилкветиапина и неустановленного метаболита М-3.
Проведено количественное определение кветиапина и его 4 метаболитов с помощью ВЭЖХ и масс-спектрометрии [27]. Исследовали 50 мкл образцов плазмы 47 пациентов, получавших 200-950 мг кветиапина в день. Образцы и внутренний стандарт (кветиапин d8) экстрагировали смесью бутилацетат-бутанол (10:1) и часть экстракта исследовали, используя колонку Сферисорб S5SСХ, элюент-метанольный раствор ацетата аммония рН 6,0. Найденные концентрации кветиапина в микрограммах в 1 мл, N- и О-дезалкилкветиапина, 7-гидроксикветиапина и сульфоксида кветиапина колебались в значительных пределах.
Разработан метод ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией (источник ионизации - электроспрей) для одновременного определения в плазме человека кветиапина и его метаболитов: сульфоксида, 7-гидрокси-, 7-гидрокси- N-дезалкилкветиапина [28]. Образцы подвергали твердофазной экстракции. Калибровочные кривые имели линейную зависимость в диапазоне 10-2000 мкг/л для кветиапина и сульфоксида, 1-200 мкг/мл для метаболитов. Выход веществ составил около 85%.
Приведены данные о метаболизме кветиапина [29]. Кветиапин подвергается метаболизму в печени благодаря системе цитохром Р-450, главным образом путем воздействия СYР3А. Главными направлениями метаболизма кветиапина являются сульфоокисление, N- и О-дезалкилирование, в меньшей степени 7-гидроксилирование. Фармакологически неактивен кветиапина сульфоксид - основной метаболит. Активностью обладает N-дезалкилкветиапин. Для исследования метаболитов применили ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией. Приведены параметры удерживания для 7-гидрокси- N-дезалкилкветиапина, кветиапина сульфоксида и N- и О-дезалкилпроизводных кветиапина.
Изучали метаболизм кветиапина in vivo при клинической терапевтической дозе [30]. Пациенты принимали мидазолам для определения ферментной активности. Концентрации кветиапина, мидазолама и их метаболитов измеряли через различные промежутки времени. Установили, что основное направление метаболизма кветиапина - сульфоокисление и N-дезалкилирование, катализируемое преимущественно ферментом CYP3.
Для исследования метаболизма кветиапина in vitro ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией с использованием электрораспыления [31]. Анализировали плазму и микросомальную фракцию печени. В плазму добавляли от 2,5 до 400 нг/мл кветиапина и оставляли при комнатной температуре на 24 ч или 3 раза замораживали. В качестве внутреннего стандарта использовали клозапин. Образцы плазмы и микросомы печени обрабатывали метанолом и экстрагировали н-бутилхлоридом. Полученные экстракты оставляли на 7-20 дней. Авторы считают, что при инкубировании кветиапина с печеночными микросомами или цитохромом Р-450 (CYP) кветиапин интенсивно метаболизируется CYP 3А4 и CYP2D6, в меньшей степени СYP3А7, CYP3А и CYP2С19.
Оланзапин, как и кветиапин, вызывает значительное количество побочных эффектов со стороны многих органов и систем организма. При передозировке отмечаются дыхательная недостаточность, остановка сердца и дыхания, нарушение сознания, угнетение ЦНС и другие синдромы.
Описан случай смертельного отравления 43-летнего амбулаторного больного, принявшего около 600 мг оланзапина [32]. В крови и моче трупа обнаружили 1238 и 6987 мкг/л оланзапина соответственно. При исследовании к 2 мл крови или мочи добавляли внутренний стандарт (флуразепам), образцы подщелачивали раствором бората натрия и оланзапин экстрагировали с помощью н-бутилацетата. Качественный и количественный анализы осуществляли с помощью газовых хроматографов (использовали приборы с различными детекторами). Найденные концентрации оланзапина в крови и моче по крайней мере в 100 раз превышали его содержание при длительном приеме терапевтических доз.
Приведены результаты определения оланзапина в 1653 образцах сыворотки крови пациентов во время лекарственного мониторинга и в 58 посмертных пробах крови [34]. Использовали газовую хроматографию (хроматографы с азотно-фосфорным детектором) после твердофазной экстракции оланзапина из 1 мл забуференной сыворотки или крови. Положительные результаты получили в 86% образцов сыворотки крови, при этом концентрация оланзапина колебалась от 5 до 75 нг/мл, в посмертных случаях содержание оланзапина в крови составило от 10 до 5200 нг/мл. Авторы считают, что посмертная концентрация оланзапина в крови в среднем составляет 160 нг/мл.
Описаны [34, 35] 2 случая определения оланзапина при отравлении мужчин. Химико-токсикологическому исследованию подвергли содержимое желудка, биологические жидкости и различные ткани и органы трупов. Оланзапин изолировали путем жидкость-жидкостной экстракции этилацетатом при рН 9,2 (аммиачный буферный раствор), реэкстрагировали в раствор серной кислоты, затем снова проводили экстракцию из щелочной среды гексаном [34] или смесью гексан-изопропанол [35]. Далее оланзапин перевели в солянокислую соль, растворили ее в метаноле, а раствор исследовали с помощью ГЖХ с различными системами детектирования. Оланзапин выявили в крови сердца в количестве 550 нг/мл, в желчи - 6346 нг/мл, в содержимом желудка - 157 нг/мл; в стекловидном теле, спинномозговой жидкости и моче оланзапин не обнаружили [34]. Во всех исследованных образцах (кроме костной ткани и спинномозговой жидкости) выявили и количественно определили оланзапин, причем наибольшее количество его оказалось в моче и ткани легких [35].
C. Vance и I. McIntyre [36] описали 28 случаев смертельных отравлений оланзапином и другими лекарственными веществами. Они привели методы определения препарата в крови, стекловидном теле, печени и в содержимом желудка. Ткань печени гомогенизировали, добавляли раствор циклизина (внутренний стандарт), аскорбиновую кислоту и проводили экстракцию 1-хлорбутаном сначала из кислой, затем из щелочной среды. После отделения органического растворителя и выпаривания сухие остатки растворяли в этилацетате. Идентификацию проводили методом ГХ-МС, количественное определение выполняли, используя газовый хроматограф с селективным азотно-фосфорным детектором. Авторы пришли к выводу, что токсические концентрации оланзапина в периферической крови составляют 1,4-6,2 мкг/мл, в центральной крови - 1,1-7,4 мкг/мл, в ткани печени - 14-88 мкг/г, в стекловидном теле - 1,1-2,1 мкг/мл.
В обзорной статье P. Chue и P. Signer [37] привели данные об определении оланзапина при исследовании биологических образцов в клинических и посмертных случаях. Авторы отметили ряд сложностей и ограничений в интерпретации посмертных данных. Как считают авторы, в 29 смертных случаях основной причиной смерти явилась передозировка оланзапином.
M. Nielsen и S. Johansen [38] подробно описали способ осаждения белков метанолом и ВЭЖХ с тандемной масс-спектрометрией для определения оланзапина в цельной крови. Метод применили для количественного определения оланзапина в 27 судебно-медицинских случаях.
Простой, чувствительный и быстрый метод ВЭЖХ с ионизацией электрораспылением и масс-спектрометрическим детектированием был разработан для одновременного количественного выявления оланзапина, клозапина, зипразидона, галоперидола, рисперидона и его главного метаболита 9-гидроксирисперидона в моче крыс [39]. В качестве внутреннего стандарта использовали мидазолам. Исследуемые вещества разделяли на колонке DC
Описан случай смертельной интоксикации оланзапином 25-летнего больного шизофренией [40]. Оланзапин количественно определили в различных органах и тканях с помощью ГЖХ с азотно-фосфорным детектированием после экстракции препарата из щелочной среды: в крови сердца оказалось 0,40, в крови сонной артерии - 0,27, в моче - 0,35 мг/л, в 50 мл содержимого желудка - 0,33 мг/л, в печени - 0,61 мг/кг. В различных отделах головного мозга обнаружены следующие концентрации оланзапина: в гиппокампе - 0,22, в среднем мозге - 0,86, в миндалинах - 0,16, в хвостатом теле - 0,39, в левой лобной коре - 0,17, в правой лобной коре - 0,37 мг/кг. В спинномозговой жидкости и мозжечке оланзапин не обнаружили.
Описан случай определения оланзапина в сыворотке крови при смертельном отравлении (суицид) [41]. Биологические жидкости трупа исследовали методами газовой хроматографии с азотно-фосфорным детектированием и ГХ-МС. В крови определили 49 мкг/л, в содержимом желудка - 410 мкг/л кветиапина.
Описано определение оланзапина в плазме крови человека методом ВЭЖХ с электрохимическим детектором (ВЭЖХ-ЕД) [42]. Препарат выделили путем твердофазной экстракции на ионообменном обращенно-фазном картридже. Предел количественного определения оказался 0,25 нг/мл при использовании 1 мл образца плазмы.
Есть сообщение о селективном методе определения оланзапина в сыворотке крови и моче пациентов [43]. Для изолирования оланзапина из сыворотки крови использовали твердофазную экстракцию, качественное и количественное определение проводили с помощью ВЭЖХ при атмосферном давлении и масс-спектрометрии с химической ионизацией. Предел количественного определения оланзапина - 1 мг/л, выход - 80%, линейность - от 1 до 1000 мг/л. Авторы установили, что оланзапин сохраняется в замороженных образцах сыворотки крови и экстрактах в течение 4 нед.
Для анализа оланзапина в плазме крови разработан быстрый и чувствительный метод ГЖХ [44]: хроматограф с селективным азотно-фосфорным детектором, кварцевая HP-5 капиллярная колонка, избирательная по отношению приблизительно к 30 психотропным веществам, газ-носитель - азот, продолжительность анализа - 7 мин. Определили линейность (от 1 до 5 нг/мл), предел определения (0,3 нг/мл); межлабораторная точность 108,7 и 88,5%.
A. Murphy и соавт. [45] сообщили о возможности получения достаточного количества метаболитов оланзапина первой и второй фазы биотрансформации (N-десметил-, 2-гидроксиметил-, 4’-N-оксид-, N-10-глюкуронид) при инкубации оланзапина с кусочками печени человека. Исследование проводили с помощью ВЭЖХ–тандемной масс-спектрометрии.
Приведены результаты исследования метаболитов оланзапина [47]. Используя различные методы (масс-спектрометрия, ядерно-магнитный резонанс, ВЭЖХ-МС), авторы доказали, что основными метаболитами оланзапина у людей являются 10-N- и 4’-N-глюкурониды. Для этого исследовали экстракты, полученные из мочи, плазмы человека и животных (мыши, крысы, обезьяны, собаки), а также химически синтезированные метаболиты.
Заключение
В литературе приведены сведения о значительном количестве смертельных и несмертельных отравлений кветиапином и оланзапином, что свидетельствует о большом токсикологическом значении этих лекарственных средств.
Описаны отдельные частные методики выделения из биологических объектов, идентификации и количественного определения исследованных веществ с использованием современных физико-химических методов анализа. Исследованию чаще всего подвергали биологические жидкости, реже - ткани внутренних органов. При разработке методик химико-токсикологического анализа исследования проводили главным образом на модельных смесях, что недостаточно, учитывая интенсивную биотрансформацию кветиапина и оланзапина в живом организме.
Данные, приведенные в литературе, могут быть использованы для разработки систематических методов анализа биологических объектов при отравлениях кветиапином и оланзапином и применения разработанных методов в практике химико-токсикологических (судебно-химических) лабораторий нашей страны.