2,4-Диметилгидроксибензол (далее 2,4-ДМГОБ) и 2,6-диметилгидроксибензол (далее 2,6-ДМГОБ) - биологически активные вещества, получаемые как синтетически, так и из природных источников и обладающие антисептическим действием. 2,4-ДМГОБ применяется в качестве фунгицида в медицине и сельском хозяйстве [1, 2].

2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ - полупродукты ряда органических синтезов, в том числе биологически активных соединений [1, 3].

По физическим свойствам 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ - это соответственно бесцветная жидкость (или кристаллы) и бесцветные кристаллы с характерным запахом и температурой плавления 27-28 °С и 49 °С [2]. Растворимость в воде (г/100 г) 2,4-ДМГОБ составляет 0,5375 (при 20 °C), 2,6-ДМГОБ - 0,6047 (при 25 °C). Оба вещества растворимы в этилацетате, этаноле, эфире, хлороформе, растворах щелочей [1, 4].

Данные соединения токсичны для теплокровных. LD50 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ для крыс составляет соответственно 562 и 1400 мг/кг. Описаны случаи отравления людей различной степени тяжести, в том числе с летальным исходом, метил- и диметилгидроксибензолами, к которым относятся рассматриваемые вещества [5, 6].

Токсические свойства 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ и наличие случаев летального отравления близкими химическими структурами делают их потенциальными объектами химико-токсикологического исследования [5, 7].

В судебно-химическом отношении вещества изучены недостаточно.

Цель настоящего исследования - изучение особенностей распределения 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ в организме теплокровных животных.

Исследовали 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ фирмы «Aldrich» с содержанием основных веществ соответственно ≥98% и ≥99,5%.

Воздействию отравляющих веществ (ОВ) подвергали крыс. Исследования проводили в соответствии с методиками, примененными ранее для изучения распределения некоторых других гидроксиаренов и их метоксипроизводных [7]. В каждом случае 25 крысам (5 опытных групп по 5 особей в каждой с массой тела 200-250 г) через зонд в желудок вводили тройную LD50 ОВ (562 × 3 мг/кг при исследовании 2,4-ДМГОБ или 1400 × 3 мг/кг при исследовании 2,6-ДМГОБ). После гибели животных, наступавшей в первые 10-15 мин после введения веществ, трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных каждой из групп, объединяли и исследовали на присутствие в них 2,4-ДМГОБ или 2,6-ДМГОБ. Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы, состоящей из 5 особей.

Изолирование. Определенное количество мелкоизмельченной биологической ткани или биожидкости заливали двукратным по массе количеством этилацетата, но не менее чем 4 мл. Смесь выдерживали 45 мин при периодическом перемешивании. Извлечение сливали с твердого остатка, процесс настаивания повторяли. Оба извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли [7, 8].

Очистка извлечений. Остаток, полученный после испарения этилацетата из объединенного извлечения, растворяли в 1,0-1,5 мл смеси гексан-диоксан-пропанол-2 (80:5:1). Раствор вносили в стеклянную колонку размером 190×11 мм, заполненную 10 г силикагеля типа L 40/100 мкм. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку добавляли элюент - смесь растворителей гексан-диоксан-пропанол-2 (80:5:1). Фракции элюата по 2 мл каждая собирали в отдельные пробирки. По 10 мкл каждой фракции наносили на хроматографическую пластину Силуфол UV-254 и хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля в стеклянных камерах с внутренним объемом около 600 см³, используя подвижную фазу хлороформ-бензол (9:1). По наличию пятен на хроматограмме, величина Rf которых соответствовала таковой стандарта, определяли наличие исследуемого вещества в той или иной фракции. Фракции элюата, содержащие 2,4-ДМГОБ (в стандартных условиях с 7-й по 13-ю фракцию) или 2,6-ДМГОБ (в стандартных условиях с 17-й по 24-ю фракцию), объединяли и упаривали вначале в токе воздуха при комнатной температуре до незначительного (0,5-1,0 мл) объема, а затем в токе азота до получения сухого остатка. Остаток растворяли в 5 мл этилацетата (исходный раствор).

В две выпарительные чашки (№1 и №2) вносили по 0,5-2,5 мл исходного раствора и испаряли растворитель в токе азота до полного удаления растворителя.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке №1 растворяли в незначительном количестве хлороформа и количественно переносили на линию старта пластины Силуфол UV-254 в виде полосы. Рядом на линию старта наносили по 5-10 мкл растворов (0,08% раствор в хлороформе) вещества-свидетеля и внутреннего стандарта (гидроксибензола). Хроматографировали, используя элюент хлороформ-бензол (9:1). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. 2,4-ДМГОБ или 2,6-ДМГОБ идентифицировали по величине Rf и Rs (по отношению к Rf гидроксибензола).

Далее то или иное анализируемое вещество элюировали из сорбента этанолом, идентифицировали по УФ-спектрам и проводили количественное определение по интенсивности поглощения в области 283 нм для 2,4-ДМГОБ и 276 нм для 2,6-ДМГОБ.

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. Пятно анализируемого вещества вырезали из хроматограммы, вносили в пробирку и элюировали 5 или 10 мл этанола путем периодического перемешивания содержимого пробирки в течение 10 мин. Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение при длине волны 200-360 нм. В случае присутствия больших концентраций анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли этанолом.

Идентификация методом ГХ МС. Остаток в чашке №2 растворяли в 2 мл хлористого метилена. Затем 4 мкл полученного раствора вводили в хроматограф фирмы «Agilent Technologies» (США) модели 6850 Network GC System с масс-селективным детектором модели 5973 Network. Пробу вводили c делением потока 1:2. Условия анализа: колонка - кварцевая капиллярная DB-5 MS EVIDEX (25 м×0,2 мм×0,33 мкм); температура инжектора 250 °C, интерфейса детектора 300 °С; начальная температура термостата колонки 70 °С поддерживалась в течение 3 мин, затем нагревали до температуры 290 °C (20 °C/мин); газ-носитель - гелий, скорость газа-носителя 0,6 мл/мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Диапазон сканирования 40-500 m/z. Вещества идентифицировали по совпадению масс-спектров с библиотечными на 86% и более. Также при идентификации учитывали характерные значения времени удерживания.

При определении 2,4-ДМГОБ и 2,6-ДМГОБ сигнал регистрировали по полному ионному току с задержкой на растворитель в 3,5 мин.

Количественное определение. По величине оптической плотности этанольного элюата, измеренного при длине волны 283 нм (для 2,4-ДМГОБ) или 276 нм (для 2,6-ДМГОБ), определяли количественное содержание соединения. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Раствор сравнения - элюат, полученный в контрольном опыте. По величине оптической плотности этанольного элюата определяли количественное содержание того или иного анализируемого вещества.

При идентификации методом ТСХ анализируемые вещества проявлялись на хроматограммах в УФ-свете в виде темных пятен на более светлом общем фоне пластины. Величины Rf и Rs 2,4-ДМГОБ (0,75 и 1,37) и 2,6-ДМГОБ (0,51 и 0,93) соответствовали величинам Rf веществ-стандартов.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии при сравнении спектральных кривых веществ, извлеченных из биоматериала и очищенных по описанной схеме, со спектрами чистых веществ в этаноле выявили совпадение форм спектральных кривых и положения точек экстремумов. Спектральные кривые, характеризующие поглощение этанольных растворов стандартов 2,4- и 2,6-ДМГОБ и этих же веществ, выделенных из ряда органов крыс, представлены на рис. 1 и 2.

При исследовании извлечений из тканей внутренних органов и биожидкостей крыс, не получавших 2,4- и 2,6-ДМГОБ, установлено отсутствие этих веществ в паренхиматозных и полых органах, а также в крови животных контрольной серии. Измеренное при длине волны 283 и 276 нм фоновое поглощение элюатов из участков хроматограмм, по площади и положению относительно линии старта соответствующих тому или иному анализируемому веществу, не превышало 0,020 ед. опт. пл. для извлечений из органов и 0,014 ед. опт. пл. из крови.

При идентификации методом ГХ МС время удерживания 2,4- и 2,6-ДМГОБ совпадало с временем удерживания веществ-стандартов и составляло соответственно 7,92 и 7,60 мин (рис. 3, 4).

На масс-спектрах присутствовали сигналы характерных осколков (заряженные частицы) для молекул 2,4-ДМГОБ (39, 51, 63, 65, 77, 91, 107, 122 m/z) и 2,6-ДМГОБ (39, 51, 60, 77, 79, 91, 107, 122 m/z) (см. рис. 3, 4).

На хроматограммах анализируемых веществ не обнаруживали (по сравнению с хроматограммами веществ-стандартов) присутствие дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.

Уравнения градуировочных графиков для фотометрического определения 2,4- и 2,6-ДМГОБ по поглощению в УФ-области спектра в данном случае соответственно имели вид: А=0,02078·С+0,04332 и А=0,01151·C±0,02162, где А - оптическая плотность, С - концентрация анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл).

Относительная ошибка среднего результата при определении 2,4- и 2,6-ДМГОБ методом УФ-спектрофотометрии не превышала 0,72 и 0,88% (n=6; p=0,95).

Результаты определения рассматриваемых гидроксиаренов в органах и крови отравленных животных представлены в таблице.

Как видно из данных таблицы, 2,4- и 2,6-ДМГОБ присутствуют в неизменном виде как в органах, так и в крови погибших организмов. Наибольшие количества данных веществ обнаруживаются в желудке, селезенке и тонкой кишке. В несколько меньшей степени 2,4-ДМГОБ присутствует также в сердце, печени и легких, а 2,6-ДМГОБ  - в печени, легких, сердце и мышцах.

1. Изучили распределение 2,4- и 2,6-ДМГОБ в организме теплокровных животных (крысы) при однократном введении тройной LD50 каждого из веществ в желудок.

2. Установили присутствие рассматриваемых веществ в неизменном виде в органах и крови погибших животных.

3. Наибольшее количество 2,4- и 2,6-ДМГОБ обнаруживается в желудке с содержимым, селезенке и тонкой кишке с содержимым.