В последнее десятилетие генотипирование STR-локусов стало рутинным не только для идентификации личности, но и для установления родственных связей [1—3]. Это, пожалуй, самый распространенный подход к установлению родства в судебной генетике в настоящее время. Широкое применение данного метода стало возможным благодаря высокой дискриминирующей способности и доступности коммерческих наборов STR-маркеров, а также развитию техники для их анализа. Распространение этого подхода потребовало унификации методик исследования биологического материала и интерпретации полученных данных. Международным обществом судебных генетиков (ISFG — International Society for Forensic Genetics) выдвинут ряд требований к организации работы лаборатории, а также к оформлению выводов и заключений [4]. Кроме того, разработаны рекомендации по генотипированию и статистической обработке генетических данных с целью установления родства [5]. В частности, для оценки вероятности родства между предполагаемыми родителем и ребенком рекомендовано рассчитывать индекс отцовства PI (Paternity Index), который по сути своей соответствует коэффициенту правдоподобия LR (Likelihood Ratio). Данная величина показывает, во сколько раз более вероятно, что конкретное лицо является родителем ребенка, чем любое другое случайно выбранное из популяции.

В литературе [6, 7] описаны случаи, когда для установления или исключения родственной связи оказывалось недостаточно исследовать только аутосомные STR-маркеры, даже по панелям из 16 локусов и более. Особенно осложнено установление родства при отсутствии одного из родителей [8]. В таких случаях простое увеличение числа исследуемых аутосомных STR-маркеров не всегда способствует разрешению проблемы [9, 10].

Для достоверных родственных пар описаны ситуации несовпадений по трем (и даже более) аутосомным STR-маркерам [6, 11].

В настоящей статье рассмотрены случаи из практики Института криминалистики Центра специальной техники ФСБ России. Для выявления родственных связей было проведено генотипирование по аутосомным STR-маркерам с последующей статистической обработкой полученных данных. В cилу разных обстоятельств результаты не могли быть интерпретированы экспертами однозначно, и для достоверного установления или исключения родственных связей потребовались дополнительные исследования половых хромосом, мтДНК, а также биаллельных маркеров.

Биологический материал, выделение ДНК. В качестве биологического материала использовали образцы крови, высушенные на марле. Выделение ДНК проводили с использованием набора реагентов DNA IQ System («Promega Corporation», США). Выделенные препараты ДНК хранили при температуре –20 °С, а высушенные на марле образцы крови — при комнатной температуре.

Оценку количества и качества выделенной ДНК проводили с помощью наборов XY-детект (ЗАО «Синтол», Россия) на приборе АНК-32 (ИАП РАН, Россия) [12].

Генотипирование STR-локусов проводили на генетическом анализаторе 3130xl («Applied Biosystems», США). Использовали амплификатор GeneAmp PCR System 9700 Gold («Applied Biosystems», США), наборы реагентов AmpF/STR Identifler Plus PCR Amplification Kit, AmpF/STR Yfiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США) и Investigator Argus X-12 Kit («Qiagen Group»). Результаты интерпретировали с помощью программного обеспечения GeneMapper ID software v. 3.2 («Applied Biosystems», США).

Генотипирование биаллельных полиморфизмов проводили на генетическом анализаторе 3130xl с использованием набора Investigator DIPplex Kit («Qiagen Group»). Результаты интерпретировали с помощью программного обеспечения GeneMapper ID software v. 3.2.

Секвенирование участков мтДНК проводили на генетическом анализаторе 3130xl, результаты интерпретировали с помощью программного пакета SeqScape («Applied Biosystems», США). Энзиматическую амплификацию участков гипервариабельных регионов HVR-I и HVR-II (мтДНК), основанную на полимеразной цепной реакции (ПЦР), проводили с использованием следующих праймеров (производство ЗАО «Синтол», Москва):

— для участка HVR-I:

прямой праймер F15971 (5'-TTAACTCCACCATTAG CACC-3');

обратный праймер R16410 (5'-GAGGATGGTGGTCA AGGGAC-3');

— для участка HVR-II:

прямой праймер F15 (5'-САСССТАТТААССАСТСА СО-3');

обратный праймер R448 (5'-TGAGATTAGTAGTAT GGGAG-3').

Для амплификации использовали набор GeneAmp PCR Core Reagents («Applied Biosystems», США), согласно прилагаемой к набору инструкции.

ПЦР проводили по методике фирмы «Applied Biosystems» на амплификаторе Gene Amp PCR System 9700 Gold по программе: инициирующая инкубация — 30 с при температуре 94 °С; 1—32-й циклы: денатурация — 20 °С при температуре 94 °С; отжиг праймеров — 10 с при при температуре 56 °С; элонгация — 30 с при температуре 72 °С.

Продукты амплификации очищали от избытка дезоксинуклеотидтрифосфатов и праймеров на устройстве Centricon 100 («Millipore Corporation», США).

Визуализацию продуктов амплификации проводили в 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием, электрофорез — при постоянном напряжении 120 В в течение 30 мин. В качестве размерного стандарта использовали 100 Base-Pair Ladder («Amersham Pharmacia Biotech Inc.», США). После разделения фрагменты ДНК визуализировали при ультрафиолетовом освещении с использованием трансиллюминатора Spectroline Ultraviolet Transilluminator («Spectronics Corporation», США).

Для секвенирования амплифицированных участков мтДНК использовали набор Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit («Applied Biosystems», США) по прилагаемой к нему инструкции и следующие праймеры (производство ЗАО «Синтол», Москва):

— для участка HVR-I:

прямой праймер F15989 (5'-CCCAAAGCTAAGATTC TAAT-3');

обратный праймер R16410 (5'-GAGGATGGTGGTCA AGGGAC-3');

— для участка HVR-II:

прямой праймер F29 (5'-CTCACGGGAGCTCTCCA TGC-3');

обратный праймер R381 (5'-GCTGGTGTTAGGGTTC TTTG-3').

Продукты амплификации очищали от непрореагировавших флюоресцентномеченых дидезоксинуклеотидтрифосфатов на микроколонках CentriSep («Princeton Separations Inc.», США).

Для расчета вероятности родства использовали программное обеспечение DNA-expert Lab, разработанное НИИ нейрокибернетики им. А.Б. Когана ЮФУ (свидетельство №2007613189, Роспатент 2007). При расчетах использовали частоты аллелей для европейской популяции, приведенные в инструкции к набору AmpF/STR Identifiler PCR Amplification Kit («Applied Biosystems», США). Рассчитывали комплексный (совокупный) индекс родства [13, 15]. Априорная вероятность родства принималась равной 50%.

Пример 1. Родственная связь типа отец—сын

Проводили молекулярно-генетическую судебную экспертизу с целью установления родственной связи отец—сын между мужчиной М1 (предполагаемый отец) и неизвестным лицом мужского пола М2 (предполагаемый сын). Использовали генотипирование по панели Identifiler Plus. Были установлены генотипы указанных лиц (табл. 1).

Для подтверждения такой близкой родственной связи, как отец—сын, провели генотипирование мужчин Ml и М2 по локусам, находящимся на мужской половой хромосоме (Y-хромосома), которая передается в поколениях от отца к сыну (см. табл. 1). В ходе генотипирования установили, что генетические профили Y-хромосомы указанных лиц мужского пола отличаются по 9 из 16 исследованных локусов. Это однозначно указывает на то, что мужчина M1 не может приходиться биологическим отцом мужчины М2.

Пример 2. Родственная связь типа мать—сын

В рамках проведения экспертизы требовалось подтвердить или опровергнуть родственную связь мать—сын между лицом женского пола N1 и неизвестным лицом мужского пола N2. Установили генотипы женщины N1 и мужчины N2 (табл. 2).

Обстоятельства уголовного дела, в рамках которого проводилось данное молекулярно-генетическое исследование, ставили под сомнение возможность такого родства. Было принято решение провести генотипирование указанных лиц по 30 биаллельным маркерам (делеционно-инсерционный полиморфизм — DIP).

DIP-маркеры представляют собой диморфные локусы, т.е. имеющие только два аллельных состояния, и отличаются короткой длиной ампликона, поэтому могут быть использованы для исследования деградированных образцов ДНК, полученных, например, из волос или костных останков. Данный тип полиморфизмов пригоден также для выявления близкородственных связей и идентификации личности [17, 18].

В ходе исследования установили, что предполагаемая мать не имеет общих аллельных вариантов (+DIP и/или –DIP) c предполагаемым сыном в 3 из 30 исследованных локусов панели DIPplex Kit: HLD45, HLD111 и HLD67. Учитывая результаты генотипирования по STR-маркерам, такой результат показался недостаточным для принятия однозначного решения об отсутствии родства между женщиной N1 и мужчиной N2.

Для устранения возникших сомнений эксперты приняли решение провести исследование мтДНК. В случае однозначного подтверждения матрилинейного родства последовательности гипервариабельных участков 1 и 2 (ГВС 1 и ГВС 2) должны быть одинаковыми, так как мтДНК передается в поколениях только по материнской линии [3, 19]. В результате секвенирования этих фрагментов мтДНК обнаружили множественные несовпадения в нуклеотидных последовательностях у данных лиц (табл. 3).

В большинстве случаев для проверки матрилинейного родства достаточно секвенирования мтДНК. К сожалению, исследование мтДНК — процесс многостадийный и трудоемкий, к тому же иногда анализ родства осложняется гетероплазмией. Удобнее для установления матрилинейного родства использовать коммерческие наборы для STR-типирования Х-хромосомы, особенно для установления родства между отцом и предполагаемой дочерью или матерью и предполагаемым сыном. Так, исследование X-хромосом женщины N1 и мужчины N2 по панели STR-локусов набора Investigator Argus Х-12 Kit выявило несовпадения аллелей в 5 из 12 исследованных локусов (табл. 4),

Пример 3. Родственная связь типа мать—дочь

Требовалось подтвердить родство между предполагаемой матерью К1 и дочерью К2. Для обоих лиц были установлены генотипы по панели Identifiler Plus, в каждом локусе генотипа дочери были аллели, свойственные генотипу предполагаемой матери (табл. 5).

Предполагаемые мать К1 и дочь К2 были генотипированы по X-хромосоме. В каждом из исследованных локусов женщины К1 и К2 имели общие аллели, что подтверждало родственную связь между ними. Кроме того, по запросу экспертов был отобран и исследован биоматериал предполагаемого отца K3 девочки К2 (табл. 6).

Совокупный индекс родства для трио отец—дочь—мать составил более 20 млрд, а вероятность родства — 99,99999999%. Согласно данным J. Birckleton и соавт. [13], такое значение «в высшей степени строго» подтверждает родство. В соответствии с приказом Минздравсоцразвития России [16] «для полного трио (мать—ребенок—предполагаемый отец) при условии, что истинность одного из родителей считается бесспорной, вероятность родства должна быть не ниже 99,90%, а индекс отцовства не ниже 1000». Кроме того, генотип Х-хромосомы девочки К2 представляет собой сочетание аллелей Х-хромосомы предполагаемого отца и предполагаемой матери (см. табл. 6), что дополнительно подтверждает родственную связь.

Приведенные примеры указывают на явную недостаточность генотипирования только STR-локусов неполовых хромосом при необходимости установления родственных связей в случае дуэта родитель—ребенок. Несомненно, наиболее достоверно можно доказать родственную связь между кем-либо из родителей и ребенком только при наличии полного трио мать—ребенок—отец, однако это идеальная ситуация и на практике исследовать трио возможно далеко не всегда.

Для подтверждения/исключения возможной родственной связи родитель—ребенок при отсутствии одного из родителей, кроме генотипирования STR-локусов аутосом, совершенно очевидна необходимость обязательно проводить дополнительные молекулярно-генетические исследования. К ним относятся генотипирование STR-локусов половых хромосом, SNP-маркеров, а также секвенирование мтДНК. Такие исследования также могут быть информативными и для установления родственных связей между другими близкородственными парами, например родными братьями и сестрами.