2-Метилгидроксибензол (орто-крезол: далее 2-МГОБ) и 3-метилгидроксибензол (мета-крезол; далее 3-МГОБ) являются полупродуктами синтеза, в том числе лекарственных средств и пестицидов, применяются в качестве консервантов, реактивов, антисептиков [1].

Данные вещества наряду с 4-метилгидроксибензолом образуются в качестве побочных продуктов коксо-газовой промышленности. В виде выбросов в атмосферу вместе со сточными водами предприятий они могут попадать в окружающую среду и накапливаться в природных объектах [2, 3].

По физическим свойствам 2-МГОБ и 3-МГОБ — соответственно бесцветные кристаллы и бесцветная жидкость с характерным запахом и температурами плавления 30,9 и 10,9 °С. Растворимость в воде 2-МГОБ составляет 25 г/л, 3-МГОБ — 24,2 г/л. Оба вещества легко растворимы в растворах щелочей, этаноле, ацетоне, бензоле, хлороформе, диоксане [1, 4].

Рассматриваемые соединения токсичны по отношению к теплокровным организмам. LD50 2-МГОБ и 3-МГОБ для крыс при внутрижелудочном введении составляет соответственно 1470 и 1160 мг/кг. Смертельная доза суммы монометилгидроксибензолов для человека составляет, по разным данным, 30—100 или 10 г при приеме внутрь. Описаны многочисленные случаи [3, 5] отравления людей изомерами монометилгидроксибензола различной степени тяжести, в том числе с летальным исходом.

Особенности распределения 2-МГОБ и 3-МГОБ в организме теплокровных после введения им летальных доз до настоящего времени изучены недостаточно [6, 7].

Цель настоящего исследования — изучение особенностей распределения 2-МГОБ и 3-МГОБ в организме теплокровных животных при летальных отравлениях.

Объектами исследования явились 2-МГОБ (фирма «Fluka»), содержание вещества ≥99,5% и 3-МГОБ (фирма «Меrck»), содержание вещества ≥99%.

В качестве модели теплокровных организмов, подвергшихся воздействию данных отравляющих веществ, использовали крыс. В каждом случае 25 крысам (5 опытных групп по 5 особей в каждой с массой 220—265 г) вводили через зонд в желудок тройную LD50 отравляющего вещества (1470 мг/кг×3 при исследовании 2-МГОБ или 1160 мг/кг×3 при исследовании 3-МГОБ). После гибели животных, смерть которых наступала в течение 10—20 мин с момента введения веществ, их трупы вскрывали, одинаковые органы и биожидкости, взятые от животных каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них 2- или 3-МГОБ.

Параллельно исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы, которая включала 5 особей.

Изолирование из тканей трупных органов и биожидкостей. Определенное количество мелкоизмельченной биологической ткани или биожидкости заливали двукратным по массе количеством этилацетата, но не меньшим чем 4 мл. Смесь выдерживали при периодическом перемешивании в течение 45 мин. Изолирующий агент сливали с твердого остатка, а процесс настаивания повторяли. Извлечения объединяли в выпарительной чашке, растворитель испаряли.

Очистка извлечений методом колоночной хроматографии. Остаток, полученный после испарения этилацетата из объединенного извлечения, растворяли в 1—1,5 мл смеси растворителей гексан—диэтиловый эфир (6:4). Полученный раствор вносили в колонку (стеклянная бюретка размером 240×15 мм), заполненную 20 г силикагеля типа L 40/100 мкм. После полного вхождения раствора в слой сорбента в колонку добавляли элюент — смесь растворителей гексан—диэтиловый эфир (6:4). Фракции элюата по 2 мл каждая собирали в отдельные пробирки. По 10 мкл каждой фракции наносили на хроматографическую пластину типа Силуфол UV-254 и хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля в стеклянных камерах с внутренним объемом приблизительно 600 см3, используя подвижную фазу дихлорэтан—бензол—диэтиловый эфир (7:2:1). По наличию пятен на хроматограмме, величина R_f которых соответствовала таковой стандарта, определяли наличие исследуемого вещества в той или иной фракции. Фракции элюата, содержащие 2-МГОБ (в стандартных условиях с 5-й по 7-ю фракцию) или 3-МГОБ (в стандартных условиях с 8-й по 11-ю фракцию), объединяли и доводили объем раствора до 5—10 мл смесью дихлорэтан—бензол—диэтиловый эфир (7:2:1) (исходный раствор). В три выпарительные чашки (№1, 2 и 3) вносили по 0,5—2,5 мл исходного раствора и испаряли растворитель в токе азота до полного удаления растворителя.

Идентификация методом ТСХ. Остаток в чашке №1 растворяли в незначительном количестве хлороформа и количественно переносили на линию старта хроматографической пластины Силуфол UV-254 в виде полосы. Одновременно на линию старта наносили раствор вещества-свидетеля (0,02% раствор в хлороформе). Хроматографировали, используя элюент дихлорэтан—бензол—диэтиловый эфир (7:2:1). Хроматограммы проявляли в УФ-свете. 2-МГОБ или 3-МГОБ идентифицировали по величине R_f.

В дальнейшем то или иное анализируемое вещество извлекали (элюировали) из сорбента этанолом, идентифицировали по УФ-спектрам, а также проводили количественное определение по интенсивности поглощения в области длинноволнового максимума (275 нм).

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. Пятно анализируемого вещества вырезали из хроматограммы, вносили в пробирку и элюировали вещество 5 или 10 мл этанола путем периодического перемешивания содержимого пробирки в течение 10 мин. Элюат отделяли и исследовали его светопоглощение в интервале длин волн 200—360 нм. В случае присутствия больших концентраций анализируемого вещества элюат предварительно разбавляли этанолом.

Идентификация методом ВЭЖХ. Остаток в чашке №2 растворяли в смеси 1 мл диоксана и 0,2 мл пропанола-2, к раствору прибавляли 3 мл гексана и 0,8 мл смеси гексан—пропанол-2 (20:1). При необходимости раствор разбавляли смесью гексан—пропанол-2 (20:1). 2—16 мкл раствора вводили в хроматограф типа Милихром. Хроматографировали в колонке размером 64×2 мм (сорбент Силасорб-600), используя элюент гексан—пропанол-2 (20:1).Скорость элюента 50 мкл/мин, скорость диаграммной ленты 720 мм/ч, масштаб регистрации 0,4 ед. опт. пл., время измерения 0,4 с. Оптическую плотность измеряли при 276 нм. Исследуемые вещества идентифицировали по характерному значению времени (объема) удерживания, совпадающему с таковым стандарта.

Количественное определение. По величине оптической плотности этанольного элюата, измеренного при длине волны 275 нм, определяли количественное содержание 2-МГОБ или 3-МГОБ. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре СФ-2000 в кюветах с длиной оптического пути 10 мм. Раствор сравнения — элюат, полученный в контрольном опыте. По величине оптической плотности этанольного элюата определяли количественное содержание того или иного анализируемого вещества.

При идентификации методом ТСХ анализируемые вещества проявлялись на хроматограммах в УФ-свете в виде темных пятен на более светлом общем фоне пластины. Величины R_f 2-МГОБ (0,65±0,02) и 3-МГОБ (0,61±0,03) соответствовали величинам R_f веществ-стандартов.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии при сравнении спектральных кривых веществ, извлеченных из биологического материала и очищенных по вышеописанной схеме, со спектрами чистых веществ в этаноле обнаруживалось совпадение форм спектральных кривых и положения точек экстремумов. Спектральные кривые, характеризующие поглощение растворов стандартов 2-МГОБ и 3-МГОБ и этих же веществ, выделенных из ряда биологических объектов (органов крыс), представлены на рисунке.

При исследовании извлечений из тканей внутренних органов и биожидкостей крыс, не получавших 2-МГОБ и 3-МГОБ, установлено отсутствие данных веществ в паренхиматозных и полых органах, а также в крови животных контрольной серии. Измеренное при длине волны 275 нм фоновое поглощение элюатов из участков хроматограмм, по площади и положению относительно линии старта соответствующих тому или иному анализируемому веществу, не превышало 0,018 ед. опт. пл. для извлечений из органов и 0,013 ед. опт. пл. — из крови.

При идентификации методом ВЭЖХ значения времени удерживания 2-МГОБ и 3-МГОБ совпадали со значениями времени удерживания веществ-стандартов и составляли соответственно 5,80 и 6,08 мин. На хроматограммах анализируемых веществ не обнаруживалось (по сравнению с хроматограммами веществ-стандартов) присутствия дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии.

Уравнения градуировочных графиков для фотометрического определения 2-МГОБ и 3-МГОБ по поглощению в УФ-области спектра в данном случае соответственно имели вид: А=0,01841·С + 0,0193 и А= 0,01642·С+0,00097, где А — оптическая плотность, С — концентрация (в мкг/мл) анализируемого вещества в фотометрируемом растворе.

Относительная ошибка среднего результата при определении 2-МГОБ и 3-МГОБ методом УФ-спектрофотометрии не превышала 0,85 и 0,75% (n=6, p=0,95).

Результаты определения рассматриваемых гидроксиаренов в органах и крови отравленных животных представлены в таблице.

Как свидетельствуют полученные данные, 2-МГОБ и 3-МГОБ присутствуют в неизменном виде как в органах (полых и паренхиматозных), так и в крови погибших организмов. Наибольшие количества 2-МГОБ обнаруживаются в желудке и крови. Присутствие значительных количеств данного вещества отмечается также в легких, печени и сердце. 3-МГОБ в большей степени присутствует в крови, мозге и тонкой кишке. Несколько меньшие его количества удается обнаружить в мозге и тонкой кишке с содержимым. Отмечается также присутствие обоих веществ в печени, селезенке, почках и мышцах.

1. Изучено распределение 2- и 3-метильных производных гидроксибензола в организме теплокровных животных (крысы) при однократном введении тройной LD₅₀ каждого из отравляющих веществ в желудок.

2. Установлено присутствие рассматриваемых веществ в неизменном виде в органах и крови погибших животных.

3. Наибольшие количества 2-метилгидроксибензола обнаруживаются в желудке и крови, а 3-метилгидроксибензола — в мозге, крови и тонкой кишке отравленных организмов.