Использование иммунологических показателей перифери­ческой крови при проведении судебно-медицинской эк­спертизы лиц, подвергшихся радиационному воздействию

В настоящее время источники ионизирующих излучений широко используются во всех сферах деятельности человека, что резко повышает вероятность возникновения чрезвычайных ситуаций радиационного характера и возможность поражения людей факторами радиационной природы. По сравнению с прошлым значительно расширился перечень источников радиационной опасности: потенциальную угрозу жизни и здоровью людей в настоящее время создает не только ядерное оружие, но и объекты атомной энергетики, медицинские, научные, промышленные и другие источники ионизирующих излучений [1, 2]. Только на территории России в организациях, использующих источники ионизирующих излучений, работают более 222 тыс. человек персонала [3]. Более разнообразными стали и условия радиационного воздействия на человека, а следовательно, и формирующиеся при этом формы лучевого поражения: не только острые, но и хронические формы патологии, лучевые реакции при облучении в малых дозах [4—6].

В большинстве случаев судебно-медицинская экспертиза радиационного поражения нелетальными дозами ионизирующих излучений касается живых лиц. Поэтому наиболее частыми объектами исследования служат биопсийный материал, а также периферическая кровь. Прижизненно взятый материал дает возможность применять широкий круг гематологических методов исследования, в том числе изучение иммунологических характеристик периферической крови.

Лимфоциты относятся к числу наиболее радиочувствительных клеток в организме, их гибель отмечается уже после радиационного воздействия в десятых долях грея (Гр). При этом погибают не только молодые, но и зрелые лимфоциты. Среди радиочувствительных клеток выделяются Т-хелперы (CD4+), и Т-супрессоры (CD8+), В-лимфоциты (CD20+) [7].

Изменение числа нейтрофилов происходит как нейтрофильный перераспределительный лейкоцитоз, наблюдающийся в течение первых суток после воздействия радиации. Чем выше доза облучения, тем выраженнее и продолжительнее развивающийся нейтрофилез. Глубина цитопении прямо зависит от дозы облучения.

В настоящий момент накоплено достаточно большое количество фактического материала о влиянии радиации на состояние иммунной системы человека. Многочисленные сообщения о состоянии иммунной системы у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС разноречивы. Вероятно, это может быть связано не только с различным временем пребывания людей в зоне повышенной радиационной опасности и разными временными промежутками исследования иммунного статуса, но и с погрешностями в определении дозы облучения. В то же время большинство авторов отмечают зависимость глубины и продолжительности иммунных расстройств от полученной дозы облучения и преморбидного фона [8, 9].

Цель настоящего исследования — комплексная оценка количественных и функционально-метаболических характеристик лейкоцитов человека после облучения проб их периферической крови в дозах 0,25, 0,50, 1,0, 4,0 Гр in vitro для разработки биологических маркеров радиационного воздействия на человека.

Оценка количественных и функционально-метаболических характеристик основных популяций лейкоцитов дана по более чем 30 лабораторным показателям. Изучена периферическая кровь 22 здоровых мужчин-добровольцев в возрасте 23—32 года.

Кровь для оценки реакций лейкоцитов на облучение in vitro у доноров-добровольцев забирали из локтевой вены в количестве 50,0 мл, и после исследования исходного состояния (фоновые данные) распределяли на 5 порций (проб).

Через 1 ч после забора 4 пробы крови в стеклянных пробирках облучали на установке РУМ-17 в дозах 0,25, 0,50, 1,0 и 4,0 Гр, с мощностью дозы 0.355 Гр/мин. 5-ю пробу подвергали ложному облучению на работающем аппарате с выключенной анодной трубкой (ложнооблученный контроль).

Общее число лейкоцитов, абсолютное количество лимфоцитов и гранулоцитов в пробах периферической крови определяли с помощью гематологического анализатора крови Coulter micro Diffis (США). Абсолютное число и относительное содержание лимфоцитов CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+ оценивали с помощью соответствующих моноклональных антител методом проточной цитометрии [10]. Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали по ответу на фитогемагглютинин в дозах 2,5 или 15,0 мгк/мл и митоген лаконоса в дозе 5,0 мкг/мл в реакции бласттрансформации [11]. Способность мононуклеаров синтезировать и продуцировать интерлейкин-1b (ИЛ)и фактор некроза опухолей α (ФНО-α) определяли на проточном цитофлюориметре EPICS XL в модификации [11].

Цитохимическими методами в нейтрофилах изучали содержание липидов, катионных белков [12], активность щелочной фосфатазы [13] и миелопероксидазы. Эффекторные свойства нейтрофилов оценивали по спонтанной и индуцированной форболмиристатацетатом (ФМА) адгезионной способности, по спонтанной и направленной миграционной активности под агарозой к N-формил-лейцин-метионил-пролину (ФЛМП) и к ИЛ-8 [11]. Функциональный потенциал нейтрофилов изучали в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который проводился в спонтанном и стимулированном зимозаном вариантах [14]. Функциональную активность нейтрофилов оценивали хемилюминесцентным методом [15]. Способность нейтрофилов к завершенному фагоцитозу изучали в тесте с дрожжами, определяя количество поглощающих дрожжи клеток и фагоцитарный индекс.

Полученные экспериментальные данные подвергали стандартной статистической обработке с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения (данные в табл. 1—3

В ходе исследований выявлено, что непосредственное радиационное воздействие на зрелые клетки периферической крови не вызывало существенных изменений в процентном соотношении основных субпопуляций лимфоцитов здоровых людей. Так, несмотря на наличие общей тенденции к снижению относительного содержания лимфоцитов CD4+, CD8+ и СD16+ после облучения в дозах 0,25, 0,50, 1,0, Гр статистически значимых различий этих показателей по сравнению с данными до облучения не выявлялось. В то же время при облучении проб периферической крови в дозе 1,0 Гр относительное содержание лимфоцитов CD16+ и CD20+ было более чем на 20% ниже исходного уровня (р>0,05). Следует отметить, что после радиационного воздействия в 1,9—2,6 раза повышалось содержание безмаркерных 0-лимфоцитов (р>0,05). Это объясняется, по всей вероятности, сбрасыванием («шеддингом») рецепторов и замедлением их синтеза de novo, т.е. на поверхности лимфоцитов изменяется плотность рецепторов, определяющих фенотип клетки, и они становятся безмаркерными при изучении методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител, направленных к CD-детерминантам.

Радиационно-индуцированное перераспределение лимфоцитов CD4+ и CD8+ приводило также и к изменению значений иммунорегуляторного индекса, которые тем не менее при всех использованных дозах не выходили за пределы физиологической нормы. В частности, после облучения in vitro проб периферической крови здоровых людей в дозе 1,0 Гр соотношение CD4/CD8 составляло 1,06±0,03 и было достоверно ниже, чем в ложнооблученном контроле (1,14±0,05).

Несмотря на отсутствие статистически значимых радиационно-индуцированных изменений в общем количестве лимфоцитов и процентном соотношении различных их субпопуляций, абсолютное число лимфоцитов CD4+, CD8+, CD16+ и CD20+ здоровых людей после облучения проб их периферической крови в дозах 0,25, 0,50 и 1,0 Гр in vitro было достоверно ниже, чем до радиационного воздействия.

Так, радиационное воздействие в дозах 0,25, 0,50, 1,0 Гр вызывало статистически значимое снижение уровня лимфоцитов CD4+ на 32, 37, 34%, цитотоксических лимфоцитов CD8+ на 30, 36, 26%, лимфоцитов CD16+ на 33, 29, 39% соответственно дозам облучения. Абсолютное число лимфоцитов CD20+ достигало достоверных различий по сравнению с контролем только при облучении проб крови в дозе 1,0 Гр (на 37%). Кроме того, дозозависимо увеличивалось количество безмаркерных лимфоцитов. В частности, после облучения проб крови в дозе 0,25 Гр число 0-лимфоцитов было в 1,5 раза выше, при дозе 0,50 Гр — в 1,6 раза выше и при дозе 1,0 Гр — более чем в 2 раза выше, чем в пробах необлученной крови.

На следующем этапе исследований было установлено, что облучение проб периферической крови здоровых людей в дозах 0,25, 0,50, 1,0 и 4,0 Гр сопровождалось увеличением количества мононуклеаров, синтезирующих и продуцирующих ИЛ-1β, который является фактором, препятствующим гибели клеток путем апоптоза [12], ФНО-α, стимулирующего процесс апоптоза, и ИФН-α, увеличивающего продукцию ИЛ-1β (см. табл. 1).

В частности, после радиационного воздействия in vitro наблюдалась общая тенденция к росту относительного содержания в периферической крови числа мононуклеаров с внутриклеточной формой ИЛ-1β, ФНО-α или ИЛ-4. Следует отметить, что при облучении проб периферической крови здоровых людей в дозе 1,0 Гр количество клеток, синтезирующих ИЛ-4, возрастало более чем в 2 раза (p<0,05). По сравнению с данными ложнооблученного контроля значимое увеличение числа мононуклеаров с внутриклеточной формой ИЛ-1β (в 2,4 раза) и ФНО-α (2,7 раза) определялось только после облучения в дозе 4,0 Гр.

Такая тенденция, характеризующаяся повышением числа клеток, синтезирующих цитокины, с увеличением дозы облучения, является следствием процессов, отражение которых многие авторы наблюдают при изучении иммунитета у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС [16].

Относительное содержание мононуклеаров с поверхностной формой ФНО-α достоверно повышалось при всех использованных дозах облучения, достигая максимальных значений (в 2,5 раза выше, чем до радиационного воздействия) после облучения в дозе 4,0 Гр. Статистически значимое увеличение числа клеток, имеющих мембранную форму ИФН-α, наблюдалось лишь после облучения проб периферической крови здоровых людей в дозе 0,50 Гр.

При оценке состояния нейтрофилов было установлено, что на фоне практически полного отсутствия изменений количественного состава гранулоцитов существенно модифицировались их функциональные и морфобиохимические показатели.

Так, непосредственное радиационное воздействие на клетки периферической крови приводило к значимому дозозависимому снижению активности щелочной фосфатазы в нейтрофилах. После облучения проб крови в дозе 0,25 Гр активность щелочной фосфатазы снижалась на 29%, при дозе 0,50 Гр — на 34%, при дозе 1,0 Гр — на 40% и при дозе 4,0 Гр — на 66% по сравнению с ложнооблученным контролем.

Ионизирующее излучение вызывало также изменения цитохимических показателей, характеризующих состояние биоцидной функции нейтрофилов. В частности, при дозах 0,25 и 0,5 Гр содержание кислороднезависимых катионных белков имело тенденцию к уменьшению, а после радиационного воздействия в дозах 1,0 и 4,0 Гр статистически значимо отличалось от фоновых значений.

Активность кислородзависимой миелопероксидазной системы в нейтрофилах в ответ на радиационное воздействие также имела тенденцию к снижению, достигая статистически значимых различий по сравнению с контролем после облучения проб крови в дозах 0,5 и 1,0 Гр (см. табл. 2).

При изучении эффекторных свойств нейтрофилов, таких как адгезия, хемотаксис и фагоцитоз, оказалось, что воздействие ионизирующего излучения в дозах 0,25, 0,50 и 1,0 Гр не оказывало заметного влияния на эти показатели.

В то же время после облучения in vitro в дозе 4,0 Гр достоверно уменьшалась способность нейтрофилов к спонтанной (на 28%) и индуцированной ФМА (на 47%) адгезии. На фоне практически полного отсутствия изменений хемотаксических свойств нейтрофилов в спонтанном и направленном к ФЛМП вариантах теста индекс миграции к ИЛ-8 прогрессивно снижался и при дозе 4,0 Гр составил 74% (р<0,05) от уровня в необлученном контроле (см. табл. 3).

Кроме того, при радиационном воздействии in vitro реакция нейтрофильных гранулоцитов как клеток неспецифической защитной системы проявлялась волнообразным изменением показателей НСТ-теста с выраженным снижением при дозе 0,5 Гр.

Оценка функционального потенциала нейтрофилов методом хемилюминесценции в спонтанном и в стимулированных вариантах и показателей фагоцитоза показала, что облучение не вызывает их существенных изменений. Вероятно, это объясняется тем, что эти клетки устойчивы к непосредственному действию ионизирующего излучения и способны выполнять свои функции в условиях экстремальных воздействий.

Облучение периферической крови человека вызывает:

— уменьшение количества различных субпопуляций лимфоцитов и увеличение количества безмаркерных 0-лимфоцитов;

— изменение иммунорегуляторного индекса;

— увеличение количества мононуклеаров, синтезирующих и продуцирующих ИЛ-1β, ФНО-α, ИФН-α;

— снижение в нейтрофильных гранулоцитах активности щелочной фосфатазы, миелопероксидазы и количества катионных белков;

— уменьшение способности нейтрофилов к спонтанной и индуцированной адгезии, снижение индекса миграции и показателей НСТ-теста.

Полученные результаты позволяют рекомендовать применение комплекса количественных и функционально-метаболических показателей лейкоцитов периферической крови в качестве дополнительных судебно-медицинских критериев диагностики радиационного воздействия у живых лиц.