Эсфенвалерат [(S)-альфа-циано-3-феноксибензил-(S)-2-(4-хлорфенил)-3-метилбутират] обладает свойствами инсектицида и широко применяется в качестве средства защиты растений.

Эсфенвалерат представляет собой белое или белое с желтоватым оттенком кристаллическое вещество, хорошо растворимое в гексане, хлороформе, этилацетате, диэтиловом эфире и плохо — в воде и этаноле [1, 2].

Данный пестицид высокотоксичен по отношению к теплокровным животным (LD₅₀ для крыс составляет 75 мг/кг). Описаны случаи отравления эсфенвалератом и близкими структурами людей, в том числе с летальным исходом. Высокая токсичность и широкое применение рассматриваемого пестицида обусловливают интерес к нему как к потенциальному объекту химико-токсикологических исследований [3].

Вопросы судебно-химического анализа эсфенвалерата остаются недостаточно изученными [4].

Цель настоящего исследования — поиск оптимальных условий определения эсфенвалерата в биологическом материале.

Объектом исследования явился эсфенвалерат (стандарт ФГУП ВНИИХСЗР, содержание вещества 99% и более). Изучали особенности изолирования эсфенвалерата из биоматериала на модельных смесях вещества (размер частиц 5—50 мкм) с тканью «свежей» трупной печени (размер частиц 0,2—0,5 см). Смеси сохраняли герметично закрытыми при комнатной температуре 24 ч. Анализируемое вещество изолировали, настаивая модельные смеси двукратно по 1 ч с различными растворителями (соотношение изолирующего агента и биоматериала по массе 2:1). Извлечения из каждой модельной смеси объединяли, часть объединенного извлечения наносили на пластину Силуфол UV-254 и хроматографировали, используя подвижную фазу гексан—метанол (8:1). Хроматограммы проявляли в УФ-свете и обнаруживали пятна эсфенвалерата (R_f=0,58±0,03). Анализируемое соединение элюировали из сорбента этанолом в течение 15 мин. Элюат фотометрировали в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 276 нм, используя спектрофотометр СФ-46. Количественное содержание эсфенвалерата рассчитывали по уравнению градуировочного графика: А=0,01052·С-0,00124 (А — оптическая плотность; С — концентрация вещества в фотометрируемом растворе, мкг/мл).

Исследовали влияние на полноту извлечения эсфенвалерата из биоматериала кратности настаивания, его продолжительности, количественного соотношения изолирующего агента и биологического объекта.

Для разработки схемы очистки эсфенвалерата от эндогенных веществ биоматериала изучали характер распределения исследуемого соединения в экстракционных системах из двух несмешивающихся жидкостей, одной из которых являлась смесь воды и диоксана, другой — гидрофобный органический растворитель (гексан, толуол, этилацетат, хлороформ или бутанол). Как еще один возможный метод очистки рассмотрена адсорбционная колоночная хроматография с использованием колонки размером 490×11 мм, заполненной 10 г силикагеля L 40/100 мкм.

С целью обнаружения и предварительной идентификации эсфенвалерата применен метод тонкослойной хроматографии — ТСХ (сорбент Silpearl, пластины Силуфол UV-254).

Изучали возможность использования методов электронной и ИК-спектрофотометрии для подтверждающей идентификации эсфенвалерата, извлеченного из биоматериала.

Для подтверждающей идентификации и количественного определения анализируемого вещества исследована также возможность применения капиллярной гaзoжидкocтнoй хроматографии с масс-селективным детектированием (ГХ МС).

Перед проведением газохроматографического определения извлеченный из биологических объектов эсфенвалерат подвергали последовательной очистке методами жидкость-жидкостной экстракции и адсорбционной колоночной хроматографии по разработанной схеме.

Идентификацию и количественное определение эсфенвалерата методом ГХ МС проводили, используя хроматограф типа Agilent 7890 А С/5975С MSD, снабженный капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м и диаметром 0,25 мм с неполярной неподвижной фазой (5% фенил)-метилполисилоксан в виде тонкой пленки толщиной 0,25 мкм.

Результаты сравнительного изучения изолирования эсфенвалерата различными изолирующими жидкостями показывают, что максимальные значения (77,6%) степени извлечения рассматриваемого вещества достигаются при использовании в качестве изолирующего агента диоксана (рис. 1).

Оптимальные условия извлечения эсфенвалерата из водно-диоксановых растворов (соотношение воды и диоксана по объему 1:4—5) могут быть достигнуты при двукратной экстракции этилацетатом (в случае равенства исходных объемов водной и органической фаз).

В условиях хроматографирования в колонке, заполненной силикагелем L 40/100 мкм, при использовании в качестве элюента смеси растворителей гексан—диоксан—пропанол-2 (150:5:1) исследуемое соединение присутствует во фракциях №14—25 (27—50 мл).

При моделировании очистки диоксанового извлечения из 25 г ткани печени от трупа, в которой заведомо отсутствовал эсфенвалерат, последовательно жидкость-жидкостной экстракцией и адсорбционной колоночной хроматографией фоновое поглощение части элюата, соответствующего фракциям, в которых может содержаться рассматриваемое соединение (0,3 части сухого остатка фракций, растворенного в 25 мл подвижной фазы), не превышает 0,012 при длине волны 276 нм (длинноволновый максимум на спектре вещества в этаноле, регистрируемый при определении методом электронной спектрофотометрии).

Изучение особенностей хроматографического поведения эсфенвалерата на пластинах Силуфол UV-254 показало, что оптимальной подвижной фазой является система растворителей гексан—хлороформ (5:5). В УФ-свете анализируемое вещество обнаруживалось в виде темно-фиолетового пятна на светло-фиолетовом фоне пластины (Rf=0,55±0,02).

Установлено, что в электронном спектре вещества присутствует несколько выраженных полос поглощения: в области 205—215 нм ε=14 250—30 680), в области 220—225 нм (ε=14 440—24 550) и в области 276—277 нм (ε=2880—4260). Для идентификации эсфенвалерата в дальнейшем в качестве растворяющей среды выбран 95% этанол.

При исследовании ИК-спектра эсфенвалерата отмечено присутствие в нем ряда характеристических полос, соответствующих определенным видам колебаний фрагментов молекулы рассматриваемого вещества (табл. 1).

Как свидетельствуют данные табл. 1, в ИК-спектре анализируемого вещества, извлеченного из ткани трупного органа (печени) и очищенного в соответствии с разработанной методикой, положение максимумов основных характеристических полос практически полностью совпадало с таковыми вещества-стандарта. Это подтверждает высокую степень очистки эсфенвалерата по предлагаемой схеме и указывает на целесообразность применения колебательной спектрофотометрии для идентификации этого вещества в извлечениях из биологического материала.

Для определения эсфенвалерата методом ГХ МС предложены условия, при которых начальная температура термостата колонки составляла 50 °С (задержка на 1 мин). Температура программировалась от 50 до 200 °C со скоростью 50 °С в 1 мин, от 200 до 280 °С со скоростью 20 °С в 1 мин с выдержкой при конечной температуре 10 мин. Температура инжектора составляла 280 °С, интерфейса — 260 °С, квадруполя — 150 °С, источника ионов — 230 °С. В качестве газа-носителя использовали гелий; скорость подачи газа-носителя 1 мл/мин. Режим без деления потока с задержкой 1 мин. Масс-селективный детектор работал в режиме электронного удара (70 эВ). Регистрация масс-спектра проводилась по полному ионному току с задержкой 8 мин. Диапазон сканирования составлял 40—550 m/z. Ток детектора 1500.

Хроматограмма, полученная в предлагаемых условиях определения, представлена на рис. 2.

При построении калибровочного графика установлена линейность в интервале концентраций 1·10^-9 — 5·10^-7 г. Методом наименьших квадратов рассчитано уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид: S=795 332·С+ 56 121 (S — площадь хроматографического пика; С — концентрация определяемого вещества в хроматографируемой пробе, нг).

На хроматограмме извлеченного из биоматериала вещества по сравнению с хроматограммой стандарта не наблюдаются дополнительные пики и заметное увеличение фонового поглощения. Параметры хроматографирования анализируемого вещества и стандарта совпадают.

Изолирование и очистка. 25 г трупного материала (ткань печени или кровь), содержащего эсфенвалерат, заливали 50 мл диоксана и выдерживали 60 мин при перемешивании. Извлечение отделяли декантацией, настаивание повторяли. Оба извлечения объединяли, упаривали при комнатной температуре в токе воздуха до объема 6—8 мл, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили объем до метки диоксаном. К 10 мл полученного раствора прибавляли 40 мл воды и экстрагировали этилацетатом (50 мл × 2). Экстракты объединяли, пропускали через бумажный фильтр и испаряли растворитель в токе воздуха до 0,5—1 мл, затем — в токе азота до сухого остатка. Остаток растворяли в 2 мл смеси гексан—диоксан—пропанол-2 (150:5:1), раствор вносили в колонку размером 490×11 мм, заполненную 10 г силикагеля L 40/100 мкм. Хроматографировали, используя элюент гексан—диоксан—пропанол-2 (150:5:1). Элюат собирали фракциями по 2 мл каждая. Фракции №14—25, содержащие вещество, испаряли в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 5 мл гексана (исходный гексановый раствор).

Идентификация методом ТСХ. 0,4 мл гексанового раствора наносили на линию старта пластины Силуфол UV-254. Хроматографировали, применяя элюент гексан-хлороформ (5:5), в присутствии вещества-свидетеля. Хроматограммы детектировали в УФ-свете и идентифицировали анализируемое вещество по величине R_f.

Идентификация методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ пятно вещества вырезали из хроматограммы, помещали в пробирку, элюировали вещество из сорбента 95% этанолом в течение 15 мин и исследовали поглощение элюата в интервале длины волны 200—360 нм на фоне контрольного раствора. Определяемое соединение идентифицировали по характерной форме спектральной кривой и положению максимумов поглощения (208 и 276 нм).

Идентификация и количественное определение методом ГХ МС. 1,0 мл гексанового раствора вносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили до метки гексаном. 2 мкл полученного раствора вводили в хроматограф типа Agilent 7890 А С/5975С MSD и хроматографировали в описанных выше условиях.

Эсфенвалерат идентифицировали по сочетанию времени удерживания вещества в неподвижной фазе колонки и специфического набора сигналов характеристических заряженных частиц в его масс-спектре.

По площади хроматографического пика в условиях регистрации интенсивности по полному ионному току определяли количественное содержание анализируемого соединения, используя уравнение градуировочного графика, и пересчитывали на навеску вещества, внесенную в биологический материал. Результаты количественного определения эсфенвалерата в трупной печени и крови представлены в табл. 2.

Согласно полученным данным, при содержании эсфенвалерата в модельных смесях от 2,0 до 20,0 мг при постоянной (25 г) массе биоматериала разработанная методика позволяет определить 74,53—76,02% эсфенвалерата в ткани печени и 78,71—79,57% данного вещества в крови.

Открываемый минимум эсфенвалерата методами ТСХ, УФ-спектрофотометрии, ИК-спектрофотометрии и ГХ МС составляет соответственно 5·10^-2, 5·10^-2; 1·10^-3 и 1·10^-5 г в 100 г биоматериала.

1. Рассмотрена возможность и определены оптимальные условия изолирования эсфенвалерата из биологического материала диоксаном.

2. Для очистки извлечений из биологических объектов применено сочетание жидкость-жидкостной экстракции и адсорбционной хроматографии в колонках силикагеля L 40/100 мкм.

3. Разработана методика идентификации и количественного определения эсфенвалерата в извлечениях из биологического материала с использованием методов ТСХ, электронной и ИК-спектрофотометрии, а также метода хромато-масс-спектрометрии (ГХ МС).