Выделение, экстракционное концентрирование и определение кофеина при исследовании плазмы крови

Кофеин (1,3,7-триметилксантин) широко применяется в качестве лекарственного средства в медицине и ветеринарии. Он оказывает сильное возбуждающее действие на центральную нервную систему, стимулирует деятельность сердца, влияет на тонус сосудов, снижает агрегацию эритроцитов. По физическим свойствам это белые кристаллы горьковатого вкуса без запаха, медленно растворимые в прохладной воде (1:60), легко — в горячей воде (1:2), трудно — в этаноле (1:50) [1, 2].

Кофеин токсичен по отношению к теплокровным животным и человеку. LD₅₀ данного соединения при введении в желудок составляет для мышей 310±20 мг/кг, для крыс 300±33 мг/кг. Известны случаи отравления людей кофеином, в том числе с летальным исходом [3, 4].

Широкое применение кофеина, его высокая токсичность, наличие случаев летального отравления обусловливают необходимость изучения данного вещества в химико-токсикологическом отношении.

Для изолирования кофеина из биологических жидкостей известно применение прямой экстракции гидрофобными органическими растворителями. Обладая одновременно свойствами кислоты и основания, кофеин способен извлекаться органическими экстрагентами как из кислых, так и из щелочных сред.

Сложность изолирования кофеина из крови и плазмы обусловлена, в частности, достаточно высокой степенью связывания данного соединения с белками крови (50—60%). Для разрушения подобных связей используют неорганические осаждающие агенты, а также ферментативный гидролиз [5, 6].

Цель исследования — изучение особенностей выделения кофеина из плазмы крови человека, его очистки и концентрирования жидкость-жидкостной экстракцией с последующим определением физико-химическими методами.

Объектом исследования являлся кофеин, соответствующий требованиям ФС 42-2426-97.

Рассмотрена возможность применения в качестве изолирующего агента ацетона, который обеспечивает высокий процент извлечения различных классов ароматических и гетероциклических соединений из биоматериала. Изучали особенности изолирования кофеина из плазмы крови ацетоном в зависимости от продолжительности его контакта с биологическим объектом, массового соотношения изолирующего агента и биоматериала. Исследования проводили на модельных смесях кофеина с плазмой крови (содержание вещества 0,05%), которые выдерживали при температуре 18—22 °С в течение 1,5 ч после их приготовления. Кофеин определяли в извлечениях методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) (пластины Сорбфил ПТСХ-АФ-А-УФ; подвижная фаза хлороформ—ацетон —25% раствор аммиака (30:30:1); детектирование в УФ-свете). Кофеин (R_f=0,60±0,03) элюировали из сорбента хлороформом в течение 10 мин. Оптическую плотность элюата измеряли при длине волны 276 нм на приборе СФ-2000 в кювете с длиной оптического пути 10 мм. Измерения проводили на фоне контрольного раствора. По величине оптической плотности определяли количество изолированного кофеина, используя при этом уравнение градуировочного графика, имеющее вид: А= 0,04605·С + 0,00124, где А — оптическая плотность, С — концентрация кофеина в фотометрируемом растворе, мкг/см³.

Изучены особенности очистки и концентрирования кофеина методом жидкость-жидкостной экстракции. При этом на модельных водно-солевых растворах кофеина проведены исследования по выбору экстрагента и поиску оптимальных условий экстрагирования. В качестве возможных экстрагентов рассматривались органические растворители различной структуры, а также смеси растворителей, каждый из которых обеспечивал высокую степень извлечения анализируемого вещества.

Для определения анализируемого вещества в экстрактах 1 см³ экстракта вносили в мерную колбу вместимостью 25 см³, доводили до метки хлороформом и измеряли оптическую плотность при 276 нм на фоне контрольного раствора. Количество кофеина, перешедшее в органический слой, определяли, используя уравнение градуировочного графика. По известным формулам [7] рассчитывали коэффициент распределения (D) и степень извлечения (R, %):

D = С_о/С_в ;

R, % = D·100%/ D+f,

где С_о и С_в — концентрации анализируемого вещества в органической и водной фазах, мг/см³, f — соотношение объемов равновесных водной и органической фаз.

Параллельно осуществляли контрольную экстракционную очистку извлечения из 5 см³ плазмы крови человека, заведомо не содержащей кофеина. ¹/₄ экстракта испаряли до объема 0,3—0,5 см³ и количественно наносили на линию старта хроматографической пластины Сорбфил. Хроматографировали в вышеописанных условиях, вещество элюировали из хроматограммы 10 мл хлороформа и измеряли оптическую плотность элюата при длине волны 276 нм.

Для обнаружения и предварительной идентификации кофеина, выделенного из биологической жидкости, изучена возможность применения хроматографии в тонких слоях сорбента СТХ-1 на пластинах Сорбфил UV-254. В качестве элюентов рассмотрены индивидуальные органические растворители различной полярности, водные растворы кислой и щелочной реакции, а также ряд двух- и трехкомпонентных подвижных фаз на их основе.

Для подтверждающей идентификации и количественного определения кофеина, выделенного из биологического материала и очищенного экстракцией, применен метод УФ-спектрофотометрии.

Для подтверждающей идентификации рассмотрена возможность применения высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Процесс хроматографирования осуществляли на приборе Waters Allians 2695 с диодно-матричным детектором (США) и колонкой размером 150×3,9 мм с сорбентом Nova Pack CN HP 4,0 мкм. В качестве подвижных фаз рассмотрен ряд полярных элюентов, состоящих из воды или водных растворов с различными значениями рН и гидрофильных органических растворителей.

Установлено, что оптимальные условия изолирования кофеина из плазмы крови ацетоном достигаются уже при однократном настаивании биологического объекта с изолирующим агентом, если массовое соотношение изолирующий агент—биоматериал составляет не менее 2:1, а продолжительность настаивания — как минимум 10 мин.

Оптимальными для экстракции кофеина из водных растворов являлись рН водного слоя 4,2—4,5, время экстрагирования 10 мин, соотношение объемов водной и органической фаз 5:1.

В табл. 1

Результаты экстрагирования смесью растворителей этилацетат—хлороформ в зависимости от их соотношения представлены в табл. 2,

В контрольных опытах с плазмой крови, не содержащей кофеин, при моделировании процессов изолирования и экстракционной очистки с одновременным концентрированием и последующим хроматографированием в тонком слое сорбента установлено, что фоновое поглощение хлороформного элюата, соответствующее ¹/₄ объема экстракта, не превышает 0,012 ед. опт. пл. при 276 нм — длине волны для определения методом спектрофотометрии. Это характеризует предлагаемый вариант очистки как достаточно эффективный.

Показано, что оптимальные условия хроматографирования кофеина на пластинах Сорбфил UV-254 могут быть достигнуты при использовании подвижных фаз этилацетат—ацетон—25% раствор аммиака (20:30:1) и хлороформ—ацетон—25% раствор аммиака (30:30:1). Последняя система применена в дальнейшем для исследований кофеина методом ТСХ.

В процессе идентификации методом УФ-спектрофотометрии при сравнении спектральных кривых кофеина, извлеченного из плазмы крови и очищенного по вышеописанной схеме, со спектром чистого вещества в хлороформе обнаруживалось совпадение формы спектральной кривой и положения точки экстремума (276 нм) (см. рисунок).

В качестве элюента для определения кофеина методом ВЭЖХ применен элюент ацетонитрил — 0,007 М дигидрофосфат калия (1:19). Скорость подачи элюента составляла 1 см³/мин. Оптическую плотность регистрировали при длине волны 274 нм. Время удерживания (t_R) кофеина составляло 2,95 мин, объем удерживания (V_R) — 2950 мкл, коэффициент емкости (kˊ) — 1,36; число теоретических тарелок (N) — 1225.

На основе предварительных исследований предложена методика определения кофеина в биологическом материале.

Методика определения кофеина в плазме крови

Изолирование кофеина. 5 см³ плазмы крови, содержащей исследуемое вещество, заливали 10 см³ ацетона и выдерживали в течение 10 мин при периодическом перемешивании. Смесь фильтровали через бумажный фильтр, который промывали 10 см³ ацетона. Объединенный фильтрат упаривали в токе воздуха при комнатной температуре до удаления ацетона (до объема 3—4 см³).

Очистка и концентрирование методом жидкость-жидкостной экстракции. Объем раствора, оставшийся в выпарительной чашке, доводили водой до 10 см³, количественно переносили в делительную воронку, добавляли высаливатель (сульфат аммония), необходимый для образования двухфазной системы, до получения насыщенного водно-солевого раствора и 2 см³ смеси этилацетат—хлороформ (2:8). Экстрагировали 10 мин до установления межфазного равновесия.

Предварительная идентификация методом ТСХ. 0,5 см³ экстракта наносили на линию старта хроматографической пластины типа Сорбфил UV-254. Хроматографировали в присутствии вещества-свидетеля, применяя элюент хлороформ—ацетон — 25% раствор аммиака (30:30:1). Анализируемое вещество идентифицировали по величине R_f.

Подтверждающая идентификация и количественное определение методом УФ-спектрофотометрии. После хроматографирования методом ТСХ участок хроматограммы с пятном анализируемого вещества вырезали, помещали в пробирку, элюировали вещество из сорбента 5 см³ хлороформа в течение 10 мин и исследовали особенности поглощения элюата в интервале длин волн 235—360 нм на фоне контрольного раствора. Определяемое соединение идентифицировали по форме спектральной кривой и положению максимума поглощения.

По величине оптической плотности, измеренной при 276 нм, определяли количественное содержание кофеина, используя уравнение градуировочного графика. Результаты количественного определения кофеина в плазме крови человека представлены в табл. 3.

Подтверждающая идентификация методом ВЭЖХ. Экстракт (1,0 см³) испаряли до сухого остатка в выпарительной чашке в токе воздуха при комнатной температуре. Остаток растворяли в 4 мл горячей воды, вносили в мерную колбу вместимостью 25 см³ и доводили до метки смесью ацетонитрил — 0,007 М дигидрофосфат калия (1:19). 2·10^-3 — 8·10^-3 см³ этого раствора вводили в хроматограф. Хроматографировали в колонке размером 150×3,9 мм с сорбентом Nova Pack CN HP 4,0 мкм. Подвижная фаза — ацетонитрил — 0,007 М дигидрофосфат калия (1:19), подаваемая со скоростью 1 см³/мин. Оптическую плотность регистрировали при 274 нм. Определяемое вещество идентифицировали по времени (объему) удерживания.

Полученные данные показывают, что увеличение содержания кофеина в модельных смесях в интервале 0,02—0,5 мг при постоянном объеме плазмы (5 см³) сопровождалось незначительным изменением среднего значения степени извлечения (не более 0,5%). Это позволяет предположить, что изолирующий агент разрушает лабильные связи кофеина с веществами биологической матрицы.

Применение ацетона в качестве изолирующего агента и предложенные условия изолирования с последующей экстракционной очисткой и концентрированием позволяют достичь достаточно высокой степени извлечения кофеина из плазмы крови. Открываемый минимум составляет 0,01 мг кофеина в 100 см³ биологического материала. Разработанная методика воспроизводима и легко выполнима.

1. Для очистки и концентрирования кофеина, изолируемого из плазмы крови ацетоном, применена жидкость-жидкостная экстракция органическими гидрофобными растворителями.

2. Оптимальные условия экстракции достигнуты при использовании смеси этилацетат—хлороформ (0,2:0,8) при рН водного слоя 4,2—4,5 в присутствии избытка электролита (сульфата аммония).

3. На основе проведенных исследований разработана методика идентификации и количественного определения кофеина в плазме крови с применением методов ТСХ, УФ-спектрофотометрии и ВЭЖХ.