В настоящее время представлено широкое разнообразие материалов для изготовления съемных пластиночных протезов. Одной из наиболее распространенных и доступных технологий остается полимеризация акриловых пластмасс [1]. Общая доля изготавливаемых пластиночных акриловых протезов составляет 80—90%. Наравне с акриловыми материалами для изготовления пластиночных протезов широко используются термопластичные и эластичные полимеры [2, 3]. К таким материалам можно отнести нейлоны, полиамиды, этиленвинилацетаты, полипропилены, полиоксиметилены, которые предусматривают применение технологии инжекционного литья или прессования с полным отсутствием остаточного мономера [4, 5]. Среди современных методов изготовления пластиночных протезов активное применение находят аддитивные технологии ламинирования и формования фотополимерной смолы [6—8]. Эта технология заключается в применении 3D-печати, например, LCD/DLP-моделирование, которое подразумевает воздействие ультрафиолетового света на частицы фотополимерной смолы в момент аддитивного изготовления изделия в пространстве 3D-принтера [9]. Применение 3D-печати повышает точность и скорость изготовления протезных конструкций, значительно сокращает технологические дефекты изделий [10, 11]. Однако, несмотря на совершенство современных базисных материалов, при взаимодействии пластиночного протеза с тканями слизистой оболочки рта характерна его контаминация микроорганизмами при эксплуатации, в связи с чем могут развиться воспалительные реакции тканей протезного ложа [12, 13]. Пористость полимера способствует более активному образованию биопленки и увеличению количества микроорганизмов, вызывающих протезные стоматиты [14]. Эпидемиологические исследования показывают, что примерно 70% пациентов с полными съемными протезами страдают протезными стоматитами, наиболее часто потенцируемыми Candida albicans [15]. Таким образом, изучение потенциального микробного обсеменения базисов съемных протезов с учетом появления новых материалов и способов их изготовления является актуальной задачей современной стоматологии.

Цель исследования — сравнительная оценка адгезии микроорганизмов к поверхности современных материалов для изготовления базисов съемных протезов.

Материал и методы

В целях исследования первичной и остаточной адгезии микроорганизмов к поверхности полимерных материалов для изготовления базисов протезов выбраны следующие материалы: акриловый полимер Villacryl H Plus (Zhermack, Италия, далее — образец 1), термопластический безмономерный полимер Vertex ThermoSens (Vertex-Dental, Нидерланды, далее — образец 2), фотополимерный акриловый олигомер Dental Denture Base (Harz Labs, Россия, далее — образец 3), полиметилметакрилатный фотополимер Dental Sand (Harz Labs, Россия, далее — образец 4).

Образцы для исследования были изготовлены в виде квадратных пластин размером 25 мм² и толщиной 1 мм в количестве 36 штук (по 12 образцов акрилового и безмономерного полимеров, по 6 образцов фотополимеров), обработанных согласно стандартному алгоритму лабораторной шлифовки и полировки базисных пластмасс. Согласно инструкции производителя материалы Dental Denture Base, Dental Sand покрывались фотополимерным лаком производства Harz Labs для создания глянцевой поверхности, сопоставимой по своим свойствам с рельефом поверхности, достигаемым при полировке традиционных полимерных базисных материалов.

В работе использованы референсные штаммы C. albicans АТСС 10231, Staphylococcus aureus АТСС 43300, Enterococcus faecalis АТСС 51299, Streptococcus mutans 10449, полученные из Государственной коллекции патогенных микроорганизмов «ГКПМ-Оболенск» [16].

Оценка первичной адгезии. Единичные колонии референтных штаммов микроорганизмов, выращенных на селективной питательной среде, помещали в стерильный изотонический раствор хлорида натрия и готовили взвесь с концентрацией микробных клеток 10⁵ КОЕ/см³. В полученную бактериальную взвесь помещали исследуемый образец и выдерживали в термостате при температуре 37 °C в течение 40 мин. После этого образцы извлекали и вносили в стерильную полужидкую транспортную среду Эймса объемом 2 мл и озвучивали при частоте 60 кГц в стерильной ультразвуковой ванне UltraEst-M («Геософт», Россия), в течение 2 мин. Отбирали по 50 мкл среды и проводили посев на кровяной агар для S. aureus, E. faecalis и S. mutans и среду Сабуро для C. albicans. Чашки Петри с посевами инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 °C в термостате, а затем чашки с посевами выдерживали при комнатной температуре в течение 24 ч, после чего проводили подсчет колоний.

Оценка остаточной адгезии. Остаточную адгезию осуществляли способом отпечатков. Взвесь микроорганизмов и ее разведение готовили аналогичным образом. На образец исследуемого материала с помощью микропипетки помещали 100 мкл приготовленной бактериальной взвеси и выдерживали в термостате при температуре 37 °C в течение 20 мин. После этого образцы промывали в 100 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в стерильной ультразвуковой ванне UltraEst-M в течение 10 мин. После промывания образцы прикладывали к поверхности плотной питательной среды (кровяной агар для S. aureus, E. faecalis и S. mutans, среда Сабуро для C. albicans) той стороной, на которую наносили взвесь микроорганизмов, для получения отпечатка. Проводили механическое распределение перенесенных отпечатков стерильным шпателем по всей поверхности питательной среды. Чашки Петри с посевами инкубировали до 5 сут, соблюдая условия анаэробиоза для E. faecalis и S. mutans. Чашки Петри с посевами на среде Сабуро инкубировали в течение 24 ч при температуре 37 °C в термостате, а затем еще в течение 24 ч при комнатной температуре. Проводили подсчет колоний, выросших на поверхности питательной среды, и вычисляли индекс адгезии микроорганизмов (I_a) по формуле:

,

где lg_a — число прикрепившихся к поверхности образцов микроорганизмов; lg_n — количество микроорганизмов в 1 см³ исходной микробной взвеси.

Расчет первичной и остаточной адгезии осуществляли по одной формуле.

Дополнительно проводили исследование образцов полимерных материалов с помощью сканирующей электронной микроскопии с полевой эмиссией (FE-SEM) на электронном микроскопе Hitachi SU8000 (Япония). Съемку изображений вели в режиме регистрации вторичных электронов при ускоряющем напряжении 10—30 кВ и рабочем расстоянии 8—10 мм.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с помощью программы StatTech v. 3.1.4 (ООО «Статтех», Россия). Показатели адгезии микроорганизмов оценивали методом нормального распределения Шапиро—Уилка. Пороговый уровень статистической значимости p (вероятность ошибочного отклонения нулевой гипотезы) соответствовал значению 0,05. Сравнение количественных показателей первичной и остаточной микробиологической адгезии проводили с помощью критерия Краскела—Уоллиса и критерия F Фишера, апостериорные сравнения — с помощью критерия Данна с поправкой Холма. Количественные данные описывали с помощью средних арифметических величин (M) и стандартных отклонений (SD).

Результаты и обсуждение

При анализе первичной адгезии C. albicans, S. aureus, E. faecalis, S. mutans выявлены статистически значимые различия между индексами адгезии к изучаемым образцам материалов. Оценены разности между каждой парой средних значений сравниваемых показателей индекса адгезии для каждого образца исследуемого материала, исходя из группирующего признака в виде штамма микроорганизма (табл. 1). Минимальный индекс первичной адгезии отмечен к образцам материалов для аддитивного производства. Разница показателей степени Ia C. albicans по результатам апостериорного анализа составила 0,15 (p=0,043) между образцами 2, 3 и 4. Разница показателей Ia S. aureus соответствовала 0,08 (p=0,045) между образцами 2, 3 и 4. Разница показателей индекса адгезии E. faecalis между образцами 2, 3 и 4 составила 0,07 (p=0,026). Для образца 1 индекс адгезии был достоверно выше, чем у образцов 3, 4 в случае с оценкой адгезии S. mutans, и имел разницу 0,07 (p=0,007). Наиболее высокий индекс адгезии во всех случаях отмечен для образца из безмономерного полимера.

Таблица 1. Индекс первичной адгезии микроорганизмов к полимерным материалам

Примечание. * — Различия пар показателей статистически значимы (p<0,05).

Известно, что основным фактором, способствующим формированию биопленки, является микрошероховатость поверхности полимера; кроме того, ортопедические конструкции подвержены микроразрушению вследствие воздействия продуктов жизнедеятельности микроорганизмов [17]. В данном случае наибольший интерес вызывают результаты исследования с C. albicans, так как скорость роста и ферментативная активность этого штамма позволяют формировать выраженную биопленку за счет выработки ферментов, подвергающих данный материал деструкции, создавая дополнительные пункты ретенции [18]. Это может быть характерно для безмономерных полимеров, имеющих относительно невысокий показатель устойчивости к микроповерждениям при их обработке [19]. Это подтверждается наибольшим показателем адгезии всех штаммов к образцу 2. Стоит отметить, что на образцах фотополимеров 3 и 4 биопленка C. albicans и S. aureus наименее выражена во всех случаях. Это можно объяснить технологией изготовления, которая предусматривает финальный этап обработки указанных материалов фотополимерным лаком, создающим глянцевую поверхность, обеспечивающую наименьший индекс первичной адгезии.

Результаты оценки остаточной адгезии микроорганизмов к образцам исследуемых полимеров представлены в табл. 2.

Таблица 2. Индекс остаточной адгезии микроорганизмов к полимерным материалам, M±SD

При анализе остаточной адгезии C. albicans, S. aureus, E. faecalis, S. mutans к образцам материалов не выявлены статистически значимые различия ни в одном случае. Индексы остаточной адгезии всех штаммов микроорганизмов были крайне низкими. При этом минимальный индекс во всех случаях отмечен к образцам 3 и 4. У материала 1 индекс остаточной адгезии был выше, чем у материалов 3 и 4, за исключением адгезии к S. mutans, где этот показатель был равен нулю.

Наблюдаемое отсутствие адгезии в случае с S. mutans можно объяснить тем, что величина адгезии этих микроорганизмов коррелирует с уровнем гликопротеидов слюны, наличие которых создает наиболее благоприятные условия для прикрепления стрептококков к поверхности полимерного материала [20]. Однако в условиях проведенного эксперимента этот фактор был исключен, что могло повлиять на степень остаточной адгезии. При этом указывается, что при 30-дневном наблюдении за микробной колонизацией S. mutans способен повышать микрошероховатость полимерных материалов, например пломбировочных [21]. В таком случае для повышения репрезентативности дальнейших исследований видится целесообразным более продолжительное наблюдение за изменениями индекса остаточной адгезии. Индекс остаточной адгезии у материала 2 был ниже, чем у материала 1, но выше, чем у образцов 3 и 4, за исключением случая адгезии к тест-штамму E. faecalis, при котором образец 2 показал наилучший результат. Исходя из данного анализа можно сделать вывод, что остаточная адгезия микроорганизмов также минимальна для представителей материалов на основе фотополимерных смол.

Указывается, что для безмономерных полимеров характерно наличие микроцарапин и микропор в связи с физико-химическими особенностями этих материалов [22]. Такая картина была характерна для материала 2: при микроскопическом исследовании выявлено, что его поверхность являлась пористой и ребристой, и это служило более благоприятной средой для адгезии микроорганизмов (рисунок, а). С точки зрения эксплуатации неблагоприятным фактором является более высокая контаминация подобной поверхности протеза микроорганизмами, что создает предпосылки для стойкого развития инфекционных агентов [13]. Наименьший показатель микрошероховатости наблюдался у образцов 1 и 3, поверхность которых была гладкой, не пористой, с небольшим количеством неровностей, что создавало затруднения к адгезии бактерий (рисунок, б). Исходя из этого можно указать, что фотополимерные и акриловые материалы могут быть более резистентными к накоплению бактерий по сравнению с безмономерными полимерами. В случае с фотополимерными материалами получаемая за счет покрытия лаком глянцевая поверхность позволяет достичь низкой степени адгезии, однако изучение нативных свойств указанных материалов и устойчивости наносимого покрытия также требует отдельного внимания.

Микрофотографии исследуемых образцов 2 (а), 3 и 4 (б).

Заключение

В ходе проведенного исследования оценена первичная и остаточная адгезия референсных штаммов микроорганизмов C. albicans, S. aureus, E. faecalis, S. mutans к поверхности современных материалов, используемых для изготовления съемных протезов. По результатам микробиологического анализа установлено, что фотополимерные материалы, используемые при аддитивном изготовлении пластиночных протезов, обладают более низкой первичной и остаточной микробной адгезией в сравнении с акриловым и безмономерным полимерами. При этом образцы безмономерного полимера показали меньший уровень устойчивости к первичной и остаточной адгезии в сравнении с акриловым по причине пористой микроструктуры. Это может ограничивать применение указанных материалов у пациентов с потенциально неблагоприятным составом микробиоты рта, например, при неудовлетворительной гигиене или низкой резистентности к присоединению бактериальных агентов.

Полученные результаты свидетельствуют, что фотополимерные материалы являются потенциально инертными с микробиологической точки зрения и могут быть рекомендованы для изготовления съемных протезов. Однако недостаточная репрезентативность данных анализа остаточной адгезии требует более углубленного изучения свойств фотополимерных материалов в сравнении с традиционными, в том числе с увеличением продолжительности наблюдений и расширением спектра бактериальных агентов.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.