Несмотря на значительные достижения современной медицины, в частности стоматологии, заболеваемость кариесом зубов остается высокой во всех странах, что представляет серьезную проблему для здравоохранения, особенно в связи со значительной стоимостью реставрационного лечения и частыми осложнениями, связанными с нарушением обменных процессов в тканях зуба [1].

Установлено, что при воздействии одних и тех же факторов риска окружающей среды (кариесогенная диета с высоким содержанием углеводов, кариесогенные бактерии и плохая гигиена рта и т.д.) некоторые пациенты могут быть более восприимчивы или резистентны к кариесу, чем другие.

Данные обстоятельства диктуют необходимость не только совершенствования стоматологической помощи, но и проведения фундаментальных исследований, которые способны регистрировать молекулярные изменения в организме человека, и прежде всего в тканях зуба и ротовой жидкости, что позволит усовершенствовать схемы лечения кариеса зубов.

В последние десятилетия возрос интерес к изучению роли витамина D в организме, что связано как с открытием механизмов его действия, выходящих далеко за рамки кальциевого обмена [2], так и с выявленным дефицитом данного биологически активного соединения в популяции Homo sapiens [3].

Найдена взаимосвязь низкого уровня витамина D и высокой распространенности кариеса как у детей, так и у взрослых [4—6]. Результаты многочисленных исследований свидетельствуют о значительном влиянии витамина D на иммунную систему [7]. Установлено, что большинство органов и клетки иммунной системы имеют рецепторы витамина D (VDR). Некоторые из этих клеток обладают возможностью метаболизировать 25(OH) витамин D в его активную форму — 1,25(OH)₂ витамин D [6, 7], оказывающую прямое воздействие на клетки иммунной системы, в частности на дендритные клетки, T-лимфоциты различных подвидов [8]. Причем фермент, ответственный за продукцию 1,25(OH)2D₃ в макрофагах и дендритных клетках, тот же самый, что и в почках (CYP27B1), с той лишь разницей, что он активируется цитокинами, а не паратгормоном, как в почках [9]. Продемонстрировано, что D-гиповитаминоз вносит существенный вклад в развитие иммунных заболеваний, хотя патофизиологические механизмы до конца не раскрыты [10].

Адекватное развитие, поддержание и завершение иммунного ответа и, соответственно, исход патологического процесса обеспечиваются молекулярными взаимодействиями клетками различных типов. Важное значение в этом процессе имеют костимулирующие и коингибирующие сигнальные молекулы, обеспечивающие работу иммунологического синапса [11]. Доказано, что презентация антигена без костимуляции приведет к развитию анергии T-лимфоцитов [12].

Система ингибиторных механизмов, регулирующих активность иммунного ответа и препятствующих тем самым развитию аутоиммунных процессов, называется иммунологическими контрольными «точками» (ИКТ), или молекулами контроля иммунитета. В настоящее время известно около 70 мембранных белков, обладающих этими свойствами [12]. Основная часть из них относится к суперсемействам иммуноглобулинов и фактору некроза опухолей (TNF). По их функциональной активности ИКТ можно подразделить на стимулирующие молекулы, способные усиливать первый сигнал через T-клеточный рецептор (TCR), и ингибирующие — ослабляющие сигнал через TCR. Преобладание ингибирующего сигнала или отсутствие ко-стимулирующего сигнала не только приводит к супрессии иммунного ответа, но и может индуцировать антиген-специфическую толерантность [12].

Так, исследование in vitro по оценке влияния витамина D на трансляцию некоторых молекул контроля иммунитета проведенное, L. Jeffery и соавт. (2015) [13], показало, что кальцитриол усиливает экспрессию CTLA-4 путем прямого воздействия на T-клетки. Этот эффект был также продемонстрирован в других работах [14].

Цель исследования — изучение уровня некоторых растворимых костимулирующих и коингибирующих сигнальных молекул (В7.2, CTLA-4, Tim-3, Lag-3, PD-1) в ротовой жидкости при кариесе зубов на фоне недостатка и/или дефицита 25(OH) витамина D в организме.

Материал и методы

В исследование были включены лица молодого возраста (от 20 до 24 лет) — студенты вузов без соматической патологии. В ходе исследования сформированы 3 группы, в каждой по 17 человек. В 1-ю группу вошли студенты с кариесом высокой степени интенсивности (КПУ выше 9) и нормальным уровнем витамина D в сыворотке крови (25(OH) витамин D >30 нг/мл). Во 2-ю группу включили лиц с высокой интенсивностью кариеса и уровнем активной формы витамина D в сыворотке крови ниже нормы (25(OH)D <30 нг/мл). Контрольную группу составили студенты со средним индексом КПУ 1,5 (от 0 до 3) и уровнем 25(OH)D в крови более 30 нг/мл.

Степень интенсивности кариеса зубов оценивали при стоматологическом осмотре, рассчитывая индекс КПУз (кариес, пломба, удаленный) по известной формуле. Концентрацию 25(OH) витамина D в крови оценивали методом хемилюминесцентного иммунного анализа на автоматическом анализаторе Access 2 (Beckman Coulter, США).

От всех участников исследования было получено добровольное информированное согласие на исследование. В работе соблюдались этические принципы, предъявляемые Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (World Medical Association Declaration of Helsinki 1964, 2013 — поправки).

Уровень костимулирующих и коингибирующих сигнальных молекул (В7.2, CTLA-4, Tim-3, Lag-3, PD-1) определяли в ротовой жидкости, которую собирали утром натощак (с 8 до 9 ч), в стеклянную пробирку без предварительной стимуляции. Биопробу очищали от муцина путем центрифугирования при 10 000 g в течение 5 мин, затем замораживали и после оттаивания повторно очищали от муцина. Определение уровня сигнальных молекул проводили с использованием набора для мультиплексного анализа Human Vascular Inflammation Panel 1 (Biolegend, США), результаты оценивали с помощью проточного цитометра Cytoflex LX (Beckman Coulter, США).

Бактериологическое исследование микробной биопленки на зубах проводили в соответствии с общепринятыми микробиологическими методами в бактериологической лаборатории Клиники ФГБОУ ВО «ЧГМА» с выделением чистых культур. Средой накопления являлась тиогликолевая среда, затем посев осуществляли на дифференциально-диагностические среды: Эндо, желточно-солевой агар, среду Сабуро, кровяной и энтерококк-агар.

При статистическом анализе полученных данных авторы руководствовались едиными требованиями для рукописей, подаваемых в биомедицинские журналы, и рекомендациями «Статистический анализ и методы в публикуемой литературе» (SAMPL). Анализ нормальности распределения признаков проводили путем оценки критерия Шапиро—Уилка. Учитывая распределение признаков, отличное от нормального, полученные данные представляли в виде медианы, первого и третьего квартилей: Me [Q₁; Q₃]. Сравнение количественных признаков выполняли с применением критерия Краскела—Уоллиса (H). При наличии статистически значимых различий с учетом поправки Бонферрони осуществляли попарное сравнение с помощью критерия Манна—Уитни (U). Для определения корреляций между исследуемыми параметрами использовали коэффициент корреляции Спирмена (ρ). Силу связи между исследуемыми параметрами определяли по шкале Чеддока. Различия показателей при p<0,05 считали статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Значения индекса КПУ и его компонентов, а также уровень 25(OH) витамина D представлены в табл. 1. Согласно представленным данным пораженных кариесом зубов в контрольной группе не было.

Таблица 1. Индекс КПУ, его компоненты и содержание 25(ОН) витамина D в сыворотке крови у лиц обследуемых групп

Примечание. * — статистически значимые различия при попарном сравнении с группой контроля с помощью критерия Манна—Уитни.

Анализ растворимых форм молекул контроля иммунитета в ротовой жидкости показал, что в группе лиц с нормальным уровнем 25(OH)D и средним значением индекса КПУ количество костимулирующих молекул B7.2 было больше на 15,0% (p=0,019) относительно контроля. В группе с высокой интенсивностью кариеса данный показатель не отличался от контрольной группы, как и другие параметры. Однако концентрация коингибирующих молекул LAG-3 была ниже, чем в 1-й группе на 12,6% (p=0,011; см. табл. 1).

Увеличение уровня молекул В7.2 можно рассматривать как благоприятный фактор, поскольку согласно современным представлениям для индукции иммунного ответа необходим сигнал, заключающийся в связывании костимулирующих молекул и их лигандов, экспрессированных на антигенпрезентирующих клетках и T-лимфоцитах. Этот сигнал обеспечивает выживание активированных лимфоцитов, и без него T-лимфоциты, распознающие антиген, переходят в состоянии анергии.

В группе с недостаточным содержанием и дефицитом 25(OH) витамина D регистрировали снижение относительно группы сравнения уровня как костимулирующих, так и коингибирующих растворимых форм молекул (табл. 2).

Таблица 2. Уровень растворимых костимулирующих и коингибирующих молекул в ротовой жидкости у лиц с высокой интенсивностью кариозного процесса и различным уровнем 25(OH) витамина D

Примечание. p₁ — для различий при попарном сравнении с контрольной группой с помощью критерия Манна—Уитни; p₂ — для различий между 1-й и 2-й группами.

Уровень молекул В7.2 отличался от контрольных значений на 48,0% (p<0,001), LAG-3 — на 56,1% (p<0,001), Tim-3 — на 44,4% (p<0,001), PD-1 — на 78,2% (p<0,001). При этом концентрации этих же молекул были ниже, чем у лиц с той же интенсивностью кариеса, но нормальным уровнем 25(OH) витамина D. Во 2-й группе уровни В7.2 на 50,6% (p<0,001), LAG-3 — на 53,9% (p<0,001), Tim-3 — на 39,1% (p<0,001), PD-1 — на 79,2% (p=0,003) были ниже, чем у пациентов 1-й группы.

Таким образом, при кариесе на фоне нормального уровня 25(OH)D отсутствуют существенные изменения в содержании коингибирующих молекул. На фоне дефицита и недостатка 25(OH)D регистрируются уменьшения количества как В7.2, так и LAG-3, Tim-3 и PD-1. Указанные изменения усугубляются с повышением степени интенсивности кариеса. Это свидетельствует о снижении функциональной активности клеток иммунного ответа — они не воспринимают ни стимулирующие, ни ингибирующие стимулы, что приводит к нарушению их дифференцировки, созревания, развитию анергии и, как следствие, усилению роста патогенной микрофлоры.

Одним из механизмов сохранения жизненной активности микробной биопленки на зубах от воздействия иммунных факторов является модуляция иммунного ответа хозяина в сторону менее эффективного или его полного торможения за счет синтеза цитокиноподобных веществ [12]. При этом T-лимфоциты переходят или в состояние senescent (окончательно зрелые и даже «стареющие» лимфоциты) или exhausted (утомленные, истощенные лимфоциты) [15]. T-клетки в состоянии senescent теряют способность экспрессировать рецепторы для костимуляции. Если же в лимфоцитах развивается состояние exhausted, то они теряют способность синтезировать IL-2, TNF-альфа, интерферон-гамма [12].

В свою очередь 1,25(OH)₂D индуцирует регуляторные T-клетки (Treg) — клетки, которые важны для подавления воспалительных процессов посредством экспрессии IL-10, коингибирующих молекул, включая PD-1 и CTLA-4 [10, 16, 17]. Вместе с тем активная форма витамина D способствует развитию Th2-иммунного ответа, угнетая экспрессию Th1-ассоциированных цитокинов, костимулирующих молекул (CD40, CD80, CD86) и увеличивая экспрессию Th2-цитокинов, в том числе IL-4 [17].

Такие процессы, с одной стороны, не позволяют уничтожить кариесогенную микрофлору, с другой — дают возможность сдерживать ее активность. Однако состояние иммунной системы будет прогрессивно ухудшаться, что может приводить к усугублению кариозного процесса.

Для подтверждения этой гипотезы мы изучали состав микробный биопленки у лиц с нормальным и пониженным уровнем витамина D. Причем в данный фрагмент работы были включены лица с одинаковым значением индекса КПУ и в отсутствие активного кариозного процесса. Установлено, что у лиц с нормальным содержанием витамина D большую долю флоры зубного налета составляли Streptococcus salivarius, Streptococcus oralis, Streptococcuss sanguis и Streptococcus gordonii. Наиболее часто выделяемыми лактобациллами были Lactobacillus casei, Lactobacillus fermentum и Lactobacillus rhamnosus, т.е. преобладали основные представители нормальной микрофлоры полости рта.

У лиц на фоне недостатка витамина D в зубном налете выявлены в большом количестве Streptococcus mutans, Streptococcus группы mitis, Candida albicans, Lactobacillus spp. и Veillonella spp. (рисунок). Уровень St. mutans (микроорганизма, обладающего наибольшим кариесогенным потенциалом), составил 7,14 lg КОЕ/мл и был в 1,45 раза выше (p=0,01), чем в контрольной группе. Практически таким же высоким оказался уровень обсемененности другим кариесогенным видом St. sanguinis — 7,23 lg КОЕ/мл. Два данных вида стрептококков выделены у 100% обследуемых. При недостатке витамина D выше, чем в контрольной группе в 1,35 раза (p=0,02), оказались концентрации Veillonella spp., C. albicans — в 1,9 раза (p=0,001), Lactobacillus spp. — в 2,17 раза (p=0,001). Все эти микроорганизмы играют определенную роль в развитии кариеса: так, различные виды Veillonella способствуют адгезии St. mutans.

Микробный пейзаж биопленки зубов у лиц с разным уровнем 25(OH) витамина D.

Полученные результаты еще раз свидетельствуют об измененной активности мукозального иммунитета рта у лиц с недостаточным содержанием витамина D.

Корреляционный анализ результатов исследования показал наличие умеренной прямой связи между содержанием 25(OH) витамина D и В7.2 (r=0,51) и наличие значительных прямых связей между уровнями активной формы витамина D и коингибирующими молекулами (табл. 3).

Таблица 3. Степень корреляции исследуемых параметров с уровнем 25(OH) витамина D

Заключение

Таким образом, дефицит витамина D приводит к снижению мукозального иммунитета полости рта, что может способствовать повышению количества кариесогенных микроорганизмов, которые выделяют различные метаболиты, в том числе цитокиноподобные вещества, усугубляющие патологический процесс, что и интенсифицирует кариозное поражение.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.