Органические кислоты, продуцируемые кариесогенными бактериями, играют важнейшую роль в деминерализации твердых тканей и образовании кариозных поражений зубов. Современные исследования подтверждают более ранние научные работы о том, что Streptococcus mutans является основным патогенным агентом, участвующим в развитии кариеса временных зубов, особенно в раннем детском возрасте, из-за их способности метаболизировать сахарозу в молочную кислоту [1, 2]. Известно, что ассоциация кариесогенных бактерий зубной биопленки помимо сахарозы ферментирует многие другие углеводы с образованием преимущественно молочной кислоты, при этом pH в основании зубной биопленки может снижаться до критического значения 5 и менее [3]. Современные научные работы, посвященные изучению деминерализации твердых тканей временных и постоянных зубов, связаны с микроскопическим исследованием (поляризационной, электронной и трансмиссионной микроскопией), микрорентгенологическим анализом морфологической структуры и химического элементного состава (это микрокомпьютерная томография, микрорентгеноспектральный анализ) [4—9]. Большинство указанных исследований проводились лабораторными методами, использование которых в полости рта не представляется возможным.
С развитием оптических флуоресцентных методов диагностики у детских стоматологов на клиническом приеме появляются новые, бесконтактные способы диагностики очаговой деминерализации твердых тканей, которые будут иметь важное значение при обследовании временных зубов у детей.
Цель исследования — совершенствование способов изучения процессов деминерализации твердых тканей временных зубов с помощью лазерной флуометрии (ЛФ) и аутофлуоресцентной микроскопии (АФМ), а также валидация критериев их оценки.
Материал и методы
В исследование включены временные вторые моляры, удаленные у детей 5—6 лет по поводу осложнений кариеса, с сохранной коронковой частью. Критерий включения в группу: сохранность одной из апроксимальных частей коронки зуба, без признаков лечения и деминерализации эмали и дентина.
Образцы зубов для исследования собирали в необходимом количестве и замораживали. Перед исследованием зубы размораживали, очищали от мягких тканей, с целью дезинфекции помещали в 0,05% водный раствор хлоргексидина биглюконата. Из этих зубов для исследования изготовили образцы: 11 сагиттальных шлифов толщиной от 3 до 4 мм. Образцы временных зубов помещали в пробирку с деминерализирующим раствором и затем в термостат при температуре 36°C на необходимое время экспозиции. Деминерализирующий раствор готовили в соответствии с рекомендациями [4]: для приготовления 50 мл буферного раствора в конической пробирке использовали 40 мл раствора молочной кислоты (лактата CH3CH(OH)COO–) концентрацией 0,05 моль и 10 мл раствора кальция фосфата Ca3(PO)2 концентрацией 2,2 ммоль. Конечный pH деминерализирующего раствора доводили до 4 с помощью раствора NaOH. Время экспозиции образцов составило 1 сут, 4 сут, 8 сут, 21 сут и 31 сут. Раствор для деминерализации меняли еженедельно в течение 1 мес.
После извлечения образцов из деминерализирующего раствора образцы обрабатывали в ультразвуковой ванночке в дистиллированной воде с тимолом, чтобы предотвратить рост бактерий. Исследования образцов проводили лабораторными методами, потенциально применяемыми в клинической практике (табл. 1).
Таблица 1. Краткое описание методов исследования твердых тканей (ТК) временных зубов
| Метод исследования ТК зуба | Аппарат (производство) | Краткое описание механизма действия метода исследования на ТК |
| Лазерная флуометрия (ЛФ) | DIAGNOdent pen 2190. Германия | Через световой зонд подводится лазерная энергия с определенной длиной волны (λ=850—950 нм; W=140 мВт/sr), которая попадает на поверхность зуба. Если возникает флуоресцентное свечение, характерное для патологического процесса, то оно анализируется аппаратом и фиксируется в условных единицах (усл. ед.) |
| Аутофлуоресцентная микроскопия (АФМ) | Аппарат светодиодный АФС «Полироник», Россия; 3D операционный микроскоп (3D RealMicro, VOMS-101, тип D, Sometech), Корея | Визуализация с помощью увеличения 3D операционного микроскопа (×30) и лазерной аутофлуоресценции патологически измененных твердых тканей зуба, вызванной в результате взаимодействия световой энергии с определенной длиной волны (λ=395 нм; W=310 мВт) светодиодного аппарата АФС с твердыми тканями зуба |
Интерпретация оценки состояния твердых тканей временных зубов с помощью аутофлуоресцентной микроскопии. Аутофлуоресцентную микроскопию образцов выполняли при увеличении ×30 в трех основных режимах работы: без аутофлуоресцентного излучения (АФИ), с АФИ, с АФИ и желтым светофильтром. Образцы изучали в зоне наиболее выраженного бугра с наибольшей толщиной эмали согласно указанным срокам экспозиции. Оценку степени деминерализации (патологических изменений) образцов твердых тканей зубов после воздействия деминерализирующего раствора осуществляли согласно разработанной нами балльной шкале (табл. 2).
Таблица 2. Балльная шкала оценки патологических изменений в образцах твердых тканей шлифов временных зубов после воздействия деминерализирующего раствора*
| Оценка, баллы | Патологические изменения |
| 0 | Видимые признаки кислотной деструкции твердых тканей отсутствуют: патологические признаки деминерализации эмали и дентина практически отсутствуют |
| 1 | Легкие признаки кислотной деструкции твердых тканей: наблюдаются признаки деминерализации в зоне эмали в виде белых пятен (в режиме без АФИ), флуоресцирующих пятен (в режиме с АФИ), темных пятен в зоне дентина (в режиме с АФИ и желтым светофильтром) |
| 2 | Умеренные признаки кислотной деструкции твердых тканей: наблюдаются признаки деминерализации в зоне эмалево-дентинного соединения в виде опалесцирующей полосы, очаги деминерализации дентина в виде пик, фиксируемые во всех трех режимах наблюдения, темных пятен в зоне эмали (в режиме с АФИ и желтым светофильтром) |
| 3 | Выраженные признаки кислотной деструкции твердых тканей: выраженные признаки деминерализации в зоне эмали в виде меловидных пятен (в режиме без АФИ), ярко флуоресцирующих пятен (в режиме с АФИ), черных пятен (в режиме с АФИ и желтым светофильтром). Деструкция эмалево-дентинного соединения в виде бороздки, определяемая во всех трех режимах наблюдения |
| 4 | Тяжелые кислотные деструктивные изменения твердых тканей: частичное разрушение эмали, эксфолиация дентина |
Примечание. * — депонирование, регистрационный номер: 799-856-840. АФИ — аутофлуоресцентное излучение.
Интерпретация оценки состояния твердых тканей временных зубов с помощью лазерной флуометрии. Измерение флуоресценции эмали и дентина образцов проводили заранее откалиброванным аппаратом KaVo DIAGNOdent pen 2190. Калибровку аппарата выполняли на интактных твердых тканях удаленного у ребенка 5 лет временного второго моляра, чтобы получить нулевое значение показателя. Затем конец световодного зонда устанавливали в исследуемый участок образца так, чтобы ощущался контакт с его поверхностью, и регистрировали показания с дисплея прибора. Использовали зонд Fissur для измерения флуоресценции. Оценку деминерализации образцов твердых тканей временных зубов осуществляли согласно балльной шкале фирмы-производителя (табл. 3).
Таблица 3. Балльная шкала оценки степени деминерализации твердых тканей (ТК) зубов прибором DIAGNOdent pen 2190*
| Состояние ТК зуба | Здоровая ТК | Начальная степень деминерализации | Сильная деминерализация |
| Значение, усл. ед. | 0—12 | 13—24 | >25 |
Примечание. * — из краткого технического описания фирмы-изготовителя.
Статистический анализ полученных данных выполняли методом простой описательной вариативной статистики. Выборки генеральной совокупности оценивали по медианным значениям с учетом интерквартильного разброса. Сравнение средних осуществляли с помощью методов непараметрической статистики по критерию U Манна—Уитни (p<0,05), для сравнения частотных показателей использовали критерий согласия Пирсона c2. Корреляционный анализ Пирсона выполняли с учетом статистической значимости коэффициентов корреляции для p<0,05. Для определения качественных характеристик метода оценки деминерализации твердых тканей образцов, полученных с помощью АФМ, использовали бинарный логистический регрессионный анализ — ROC-анализ. Расчеты проводили с помощью программ Statistica 10.0 (StatSoft, США), Microsoft Excel 2019.
Результаты и обсуждение
Микрофотографии, полученные в результате исследования образцов с помощью АФМ в трех основных режимах работы: без АФИ, с АФИ, с АФИ и желтым светофильтром на 0-е, 4-е, 8-е, 21-е и 31-е сутки эксперимента, представлены на рис. 1.
Рис. 1. Микрофотографии зуба в трех основных режимах работы: без аутофлуоресцентного излучения (АФИ), с АФИ, с АФИ и желтым светофильтром (×30).
Данные визуальной оценки динамики деминерализации образцов по разработанной нами балльной шкале оценки патологических изменений в образцах твердых тканей шлифов временных зубов после воздействия деминерализирующего раствора отражены также на рис. 1.
Уровень деминерализации твердой ткани временных зубов равномерно увеличивается до 21-х суток, а потом выходит на плато. При этом значимый интерквартильный разброс отмечается на 8-е сутки, а в остальных точках он нулевой (рис. 2).
Рис. 2. Динамика деминерализации по интегральному показателю изменения средних (медианных) значений в группе образцов на 0-е, 4-е, 8-е, 21-е и 31-е сутки эксперимента.
Данные объективной оценки (в условных единицах — усл. ед.) динамики деминерализации 11 образцов, полученные с помощью аппарата KaVo DIAGNOdent pen 2190, представлены на рис. 3.
Рис. 3. Оценка динамики деминерализации тканей зуба в эксперименте методом лазерной флуоресценции в группе образцов на 0-е, 4-е, 8-е, 21-е и 31-е сутки эксперимента.
При анализе диаграмм (см. рис. 2, 3) установлено, что до 8-х суток процессы деминерализации, выявляемые с помощью АФМ и ЛФ в эмали и дентине образцов, происходят практически синхронно до умеренных признаков кислотной деструкции твердых тканей (код 2) и практически при одинаковых значениях флуоресценции до 9 усл. ед. На 21-е сутки, когда в образцах отчетливо методом АФМ фиксируются тяжелые кислотные деструктивные изменения (код 4), отмечается резкий рост показателей флуоресценции эмали (почти в 16 раз) — с 5 до 80 усл. ед. с выходом на плато к 31-м суткам эксперимента. Однако показатели флуоресценции дентина в образцах увеличиваются более чем 2 раза — с 9 до 20 усл. ед., а на 31-е сутки эксперимента продолжают увеличиваться до 30 усл. ед. Таким образом, процесс деминерализации эмали в образцах за все время эксперимента происходит значительно быстрее и ведет к частичному ее растворению уже к 21-м суткам экспозиции в деминерализирующем растворе. Процесс деминерализации дентина продолжается медленнее и прогрессивно увеличивается в течение всего эксперимента, явление частичного растворения не фиксируются, однако наблюдаются иные признаки кислотной деградации твердой ткани в виде расслоения или эксфолиации размягченных участков.
В естественных условиях ротовой полости на процесс очаговой деминерализации временных зубов влияет локализация зубной биопленки на поверхности клинической коронки (рис. 4); микроморфологический контроль процесса деминерализации довольно сложен.
Рис. 4. Зуб 8.5 у ребенка 4 лет после окрашивания зубной биопленки индикатором зубного налета: наблюдается интенсивное окрашивание зубной биопленки — синим цветом, локализация окрашивания свидетельствует о сложной геометрии вероятных очагов деминерализации.
По некоторым данным, кариозные поражения на временных зубах геометрически более вариабельны, развиваются на фоне физиологической гипоминерализации твердых тканей, быстрее прогрессируют — с различной шириной, глубиной, тяжестью и цветом дефектов [10, 11]. Основным этиотропным фактором служит зубная биопленка [12]; адгезия кариесогенных микроорганизмов с последующей колонизацией твердых тканей временных зубов начинается со штаммов Streptococcus sanguinis и является первой стадией формирования мягкого зубного налета (зубной биопленки). По данным ряда исследований [13, 14], важное патогенетическое значение имеет способность оральных стрептококков образовывать внеклеточные полисахариды, а также выделять протеолитические ферменты и эндотоксины. Образование гликана вызывает межклеточную агрегацию Streptococcus mutans и других бактерий, содержащихся в ротовой жидкости, например Noccardia, Neisseria, Actinomyces vicosus, Candida albicans и др. Таким образом, экспериментальная модель по деминерализации временных зубов позволяет лучше контролировать процесс деминерализации в динамике, выполнять объективный контроль его стадий с целью валидации критериев оценки и использования последних в клинической практике.
Данные корреляционного анализа Пирсона полученных с помощью АФМ и ЛФ показателей 11 образцов от начала эксперимента и через 4 сут, 8 сут, 21 сут и 31 сут представлены на рис. 5.
Рис. 5. Диаграмма рассеяния для эмали (а) и дентина (б) показателей деминерализации, определяемой методами АФМ (в баллах) и ЛФ (в усл. ед.), в образцах твердых тканей временных зубов.
ЛФ — лазерная флуометрия; АФМ — аутофлуоресцентная микроскопия.
Результаты корреляционного анализа показателей исследуемых образцов твердых тканей временных зубов (см. рис. 5) позволяют констатировать, что между балльными оценками, полученными с помощью АФМ, и оценками в усл. ед. с помощью ЛФ существует прямая корреляция. Причем корреляция оценок, полученных с помощью ЛФ, для эмали выше (r=0,84), чем для дентина (r=0,76). Можно отметить, что большинство значений показателей деминерализации, полученных с помощью АФМ, для дентина расположены выше корреляционной прямой и доверительного интервала. Показатели деминерализации, полученные с помощью АФМ для эмали, располагаются несколько ближе к корреляционной прямой.
Для определения специфичности и чувствительности градации балльных оценок, полученных с помощью АФМ, относительно оценок, полученных с помощью ЛФ, выполняли бинарный логистический регрессионный анализ с построением ROC-кривых. Согласно полученным данным, площадь под ROC-кривой (AUC) характеризует качество классификатора, а точность, специфичность и чувствительность определяют качественные характеристики метода. Средние (медианные) значения показателей, полученных с помощью ЛФ, и ROC-кривые для показателей деминерализации эмали и дентина представлены на рис. 6. Результаты ROC-анализа приведены в табл. 4.
Рис. 6. ROC-кривые для показателей деминерализации твердых тканей образцов, полученных с помощью метода ЛФ, относительно показателей деминерализации твердых тканей образцов, полученных с помощью метода АФМ.
ЛФ — лазерная флуометрия; АФМ — аутофлуоресцентная микроскопия
а—г — приведены значения уровня p для статистически значимых различий между соседними значениями, рассчитанные по критерию U Манна—Уитни.
Таблица 4. Результаты бинарного логистического регрессионного анализа показателей деминерализации твердых тканей образцов, полученные с помощью метода ЛФ (в усл. ед.), и показателей деминерализации твердых тканей образцов, полученные с помощью метода АФМ (в баллах)
| Параметр ROC-анализа | Дентин | Эмаль | ||||
| 0—1 | 1—2 | 2—3 | 0—1 | 1—2 | 2—3 | |
| Площадь под ROC-кривой (AUC) | 0,94 | 0,70 | 0,91 | 0,94 | 0,61 | 0,84 |
| Точка отсечения (cut off) | 0,0 | 4,0 | 12,0 | 5,9 | 9,3 | 16,0 |
| Специфичность, % | 100,0 | 90,0 | 100,0 | 100,0 | 100,0 | 40,0 |
| Чувствительность, % | 100,0 | 40,0 | 83,3 | 100,0 | 0,0 | 100,0 |
| Точность, % | 100,0 | 73,3 | 87,0 | 100,0 | 66,7 | 87,0 |
Примечание. ЛФ — лазерная флуометрия; АФМ — аутофлуоресцентная микроскопия.
Согласно представленным в табл. 4 данным, показатель AUC не был менее 0,5, что указывает на приемлемость настоящего классификатора для интегральной оценки деминерализации тканей зубов. Анализ графиков (см. рис. 6, а, б) показывает, что различия средних оценок показателей ЛФ между 2-м и 3-м баллом статистически незначимы. При этом сохраняется высокая специфичность классификатора: 90% для дентина и 100% для эмали. По совокупности показателей ROC-анализа можно отметить, что оценка в баллах результатов АФМ для дентина является более точной, несмотря на то что корреляция между показателями выше для эмали. Таким образом, особенностью балльной оценки является достаточно четкая формализация. Кривая на рис. 3 в большей степени соответствует кривой кислотной деминерализации эмали, где также отмечается плато на 21-е и 31-е сутки. Подтверждается более сильная корреляция показателей, полученных при АФМ и ЛФ, для эмали. Низкие значения AUC для границы 1—2 балла можно подтвердить различными тенденциями кривых на рис. 6, в, г в период 4—8-х суток эксперимента. На основании полученных данных можно отметить, что разработанная 4-балльная шкала оценок с помощью АФМ может дополнять клинические методы оценки деминерализации твердых тканей временных зубов и может быть использована в качестве интегральной оценочной шкалы деминерализации твердых тканей зуба.
Выводы
1. Для интегральной оценки деминерализации твердых тканей шлифов временных зубов можно использовать аутофлуоресцентную микроскопию с 4-балльной шкалой оценки патологических изменений после воздействия деминерализирующего раствора. Логистический регрессионный анализ выявил состоятельность классификатора для прогностической точности каждой единицы предлагаемой шкалы.
2. Деминерализация образцов твердых тканей шлифов временных зубов происходит неравномерно. Эмаль образцов до 8-х суток деминерализуется медленно и равномерно, с минимальными объективными признаками; начиная с 8-х суток эксперимента наблюдается существенный рост показателей деминерализации. К 21-м суткам достигается пик деминерализации — с частичным растворением эмали, усилением эффекта флуоресценции до 80 усл. ед. и максимум — 4 балла по оценочной шкале метода АФМ.
3. Твердые ткани дентина деминерализуется постепенно, без резких скачков эффекта флуоресценции и с одинаковой скоростью за все время эксперимента, максимум (30 усл. ед.) достигается на 31-е сутки. Процессы деминерализации твердых тканей дентина и эмали в образцах, визуально выявляемые с помощью аутофлуоресцентной микроскопии, морфологически различаются. Деминерализация дентина характеризуются меньшим растворением, однако определяется явление расслоения по типу эксфолиации органической матрицы дентина начиная с 21-х суток эксперимента.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — А.Г. Седойкин, Л.П. Кисельникова, С.Н. Ермольев
Сбор и обработка материала — А.Г. Седойкин, С.Н. Ермольев, А.М. Затевалов, А.А. Фокина
Написание текста — А.Г. Седойкин, Л.П. Затевалов, А.А. Фокина
Редактирование — Л.П. Кисельникова, А.А. Фокина
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Participation of authors:
Concept and design of the study — A.G. Sedoykin, L.P. Kiselnikova, S.N. Ermolyev
Data collection and processing — A.G. Sedoykin, S.N. Ermolyev, A.M. Zatevalov, A.A. Fokina
Text writing — A.G. Sedoykin, A.M. Zatevalov, A.A. Fokina
Editing — L.P. Kiselnikova, A.A. Fokina