Современная концепция развития стоматологии вовлекает новые молекулярные инструменты и нанотехнологические подходы для реализации персонализированного медицинского обслуживания. На основании уникальных характеристик твердой зубной ткани человека в стоматологическом материаловедении разрабатываются концептуально новые биомиметические материалы, буферные и бондинговые системы, что позволяет достичь высокого уровня восстановления твердой ткани зуба. Известно, что ключевым фактором долговременной и качественной реставрации утраченной зубной ткани является организация интерфейса дентин—адгезив—стоматологический материал [1, 2]. Требования к высокой морфологической организации подготовленной поверхности дентина определяют будущую структуру межфазной границы дентин/композит и устанавливают необходимость ее контроля и мониторинга [1, 3, 4].

В настоящее время формирование устойчивой связи между реставрационным материалом и твердой тканью зуба обеспечивается различными по природе бондинговыми системами [1, 2, 5]. Связь достигается через образование гибридного слоя, который формируется внутри препарированной деминерализованной коллагеновой сети дентина [2, 5, 6]. Имеющиеся стратегии формирования гибридного слоя основываются на новых подходах и достижениях нанотехнологий [2, 6, 7]. В рамках этой концепции для инжиниринга гибридного биоинтерфейса целесообразно использовать материалы, которые по своему молекулярному составу, химическим и морфологическим характеристикам имеют максимальное родство естественному апатиту эмали и дентина, а также их аминокислотному матриксу [7—9]. Существует предположение, подтверждаемое в том числе и нашими работами, что формирование качественного биоинтерфейса между синтетическим материалом и природной твердой тканью зуба может быть реализовано на основе биомиметического гибридного слоя, созданного с использованием нанокристаллического карбонатзамещенного гидроксиапатита (nano-c-HAp) и ряда полярных аминокислот [7, 9, 10].

Цель исследования — изучение особенностей молекулярного состава биоинтерфейса между нативной зубной тканью человека и стоматологическим композитом, созданного в условиях щелочной среды, на основе синхротронного химического инфракрасного микрокартирования и последующего многомерного кластерного анализа собранного массива спектральных данных.

Материал и методы

Методика подготовки образцов зубов. Для исследований мы использовали здоровые третьи моляры, удаленные по ортодонтическим показаниям у пациентов в возрасте 18—25 лет в стоматологической клинике Воронежского государственного медицинского университета им. Н.Н. Бурденко. Пациенты были физически здоровыми, что подтверждалось записями из индивидуальных амбулаторных карт, не имели вредных привычек, не курили. После удаления зубы помещали в отдельные флаконы, содержащие 0,9% раствор хлорида натрия и 0,002% азида натрия и хранили при температуре 4 °C.

Сначала поверхность эмали очищали механически с использованием мелокоабразивной пасты и мягкой щетки. После этого с использованием Er: YAG импульсного лазера (2940 нм, длительность 75—500 мкс, частота 10—50 Гц, P_Max =8W) с водяным охлаждением дистиллированной водой, в эмали, а затем и в дентине была сформирована полость цилиндрической формы. Полученная полость промывалась и просушивалась потоком воздуха от компрессора. Затем отпрепарированная полость зубов для образцов второго типа обрабатывалась раствором, содержащим оксид кальция для получения щелочной среды pH >11. По данным литературы, защелачивание активизирует образование функциональных молекулярных связей гидроксиапатит-аминокислота [10].

Подготовленные таким образом 10 зубов были разделены случайным образом на 2 равные группы для лечения с использованием двух различных подходов.

Для создания образцов первого типа использовали бондинговую систему, которая включала коммерческий адгезив на основе BisGMA [11], стоматологический компомерный материал DyractXP, дентин-кондиционер и биопраймер.

Вначале стенки и дно сформированной в дентине полости обрабатывали дентин-кондиционером. После этого на стенки и дно полости наносили тонкий слой биопраймера. После этого на подготовленную полость наносили универсальный адгезив и светоотверждаемый композит DyractXP и, следуя инструкции производителя, проводили его фотополимеризацию.

Для создания образцов второго типа с гибридным биомиметическим интерфейсом между дентином и стоматологическим материалом мы также использовали коммерческий стоматологический компомерный материал DyractXP и биопраймер. При этом был использован модифицированный дентин-кондиционер и модифицированный адгезив на основе BisGMA.

Принимая во внимание требования методики исследования (ИК-микрокартирование) к геометрии образцов, мы подготовили плоскопараллельные сегменты образцов отреставрированных зубов, аналогично тем, которые были исследованы в работах P. Seredin и соавт. [12], D. Goloshchapov и соавт. [13]. Для разделения образцов зубов использовали низкооборотную алмазную пилу с водяным охлаждением. Полученные слои твердой ткани подвергали бережному шлифованию с последующей полировкой с использованием алмазного абразива.

Использованные материалы. Дентин-кондиционер. В состав дентина-кондиционера входит комплекс слабоконцентрированных (до 12%) предельных и непредельных полифункциональных органических кислот (малеиновая кислота, полиакриловая кислота, лимонная кислота, дистиллированная вода).

Модифицированный дентин-кондиционер. В состав оригинального кондиционера добавлены основные полярные аминокислоты (лизин, аргинин, гиалуроновая кислота), за счет которых может возникать связь с апатитом дентина буферного слоя и бонда. Аминокислоты были растворены в водном растворе и подвергнуты смешиванию с оригинальным дентин-кондиционером с использованием ультразвукового диспергатора (QSonica Q55).

Биопраймер. Используется для внесения в дентинные канальцы компонентов бонда. Включает компоненты компомера (метиловый эфир этиленгликоля 30—85%, уретандиметакрилат 1—15%, гидрофильный мономер диглицидилметакрилат 1—15%) и комплекс полярных аминокислот для повышения тропности к твердым тканям зуба, которые служат для синтеза катионного белка (гистидин — 0,01—0,2%, лизин — 0,05—0,4%, аргинин — 0,2—1,6% от общего весового количества праймера).

Модифицированный адгезив. В оригинальный адгезив на основе BisGMA был введен порошкообразный нанокристаллический карбонатзамещенный гидроксиапатит (1 мл адгезива — 0,01 г nano-c-HAp). Наполнение адгезива nano-c-HAp способствует как устранению напряжений, которые могут образовываться при полимеризации, так и способствовать повышению твердости слоев [14]. Смешивание компонент nano-c-HAp и адгезива осуществлялось с использованием ультразвукового гомогенизатора QSonica 55W.

Наноразмерный карбонат-замещенный гидроксиапатит кальция (nano-c-HAp). Наноразмерный карбонатзамещенный гидроксиапатит кальция (КГАП) был получен с использованием яичной скорлупы птиц методом жидкофазного синтеза по отработанной нами методике [15]. Морфологическая организация синтезированного по этой технологии nano-c-HAp сходна с той, которой обладают твердые ткани зуба человека, так как образована нанокристаллами со средними размерами 20×20×50 нм [15]. Такая характеристика является весьма важной особенностью для формирования биомиметического материала, способного восполнить естественный биогенный КГАП [2].

Синхротронная ИК-микроспектроскопия. Синхротронные исследования образцов были проведены на канале инфракрасной микроскопии — IRM («Австралийский синхротрон», Мельбурн, Австралия) с использованием спектрометра Bruker Vertex 80v в сочетании с FTIR-микроскопом Hyperion 3000 (Bruker Optik GmbH, Эттлинген, Германия). Зубные срезы приводили в контакт с кристаллом Ge, после чего собирали 3D ИК-карты с участков интерфейса образцов.

Иерархический кластерный анализ. Спектральные данные 3D FTIR-карт образцов были оценены с использованием метода иерархического кластерного анализа (ИКС). ИКС является многомерным статистическим подходом для классификации спектроскопической информации. С использованием метода ИКС можно идентифицировать области в структуре образца по их спектральному отклику. Те области, точки внутри которых имеют сходный спектральный отклик, также имеют и минимальные внутрикластерные спектральные различия. При этом максимальные межкластерные различия будут у областей с разным спектральным откликами [16].

Определение числа кластеров было выполнено с учетом технологических данных и результатов построения дендрограммы гетерогенности.

Результаты и обсуждение

Для каждого из 10 созданных нами образцов I и II типа с использованием комбинированной техники ИК-микроспектроскопии с высоким пространственным разрешением (примерно 1 мкм) были изучены участки интерфейса здоровый дентин/адгезив/стоматологический материал. Участки для анализа выбирали с использованием оптического микроскопа, включенного в измерительную схему. Для детального анализа выбирали области интерфейса 24×36 мкм², в которых не наблюдались механические дефекты от полировки или другие дефекты.

На рис. 1 представлены видимые изображения участков интерфейса здоровый дентин/адгезивный слой, характерные для образцов I и II типа. На изображениях хорошо видны две области, а именно участок здорового дентина и зона адгезив/стоматологический материал.

Рис. 1. Оптические изображения характерных участков интерфейса для образцов I и II типов.

а — изображение участка интерфейса образца I типа; б — изображение участка интерфейса образца II типа. Пунктирной линией обозначены участки интерфейса 24×36 мкм², для которых выполнено химическое инфракрасное микрокартирование.

С использованием техники синхротронной ИК-микроспектроскопии было выполнено картирование интересующих областей с шагом 1 мкм. Таким образом, от каждой точки поверхности площадью 1×1 мкм² в выбранных зонах интерфейса (см. рис. 1) были получены ИК-спектры, несущие информацию о молекулярном составе исследуемого образца.

В дальнейшем с применением процедуры кластерного анализа нам удалось разделить собранный массив экспериментальных спектральных данных на группы спектров (кластеры) таким образом, что внутри каждого кластера спектры обладают явным сродством (максимальной близостью друг к другу в соответствии с выбранной при проведении кластерного анализа функцией близости), но при этом наблюдаются статистически значимые различия в спектрах между кластерами. Как было отмечено ранее, число кластеров для образцов I и II типов определяли, исходя из результатов построения дендрограммы гетерогенности и с учетом технологических данных.

Результаты кластерного анализа (рис. 2) представлены с использованием цветового кодирования. Все точки сканированной области в пределах одного кластера имеют свой цвет. Хорошо видно, что в области интерфейса здоровый дентин/адгезив/стоматологический материал для образцов I и II типов характерно наличие разного числа кластеров. Так, для образцов I типа (см. рис. 2, а) на границе раздела наблюдаются 4 различных кластера, в то время как для образцов II типа (см. рис. 2, б) характерно наличие 6 кластеров. Кроме того, хорошо видно, что ширина сформированной межграничной области для образцов I и II типов также разная: примерно 12 мкм и примерно 20 мкм соответственно.

Рис. 2. Результаты кластерного анализа инфракрасных карт, сформированных для образцов I (а) и II (б) типов.

Латеральное расположение кластеров позволило нам зонировать характерные для интерфейса I и II типов участки. При этом можно заметить, что границы между соседними кластерами у образцов II типа имеют более выраженную прямую форму.

Анализ спектральных данных был выполнен на основе ряда источников литературы, в которых методом FTIR исследовали образцы здорового дентина, стоматологического материала, адгезива, а также материалов, использованных при создании биомиметического гибридного слоя в образцах II типа [4, 11, 17, 18].

Сопоставление данных литературы и экспериментов показывает, что в образцах I типа первый кластер — C₁ представляет собой зону здорового дентина (см. рис. 2). Второй кластер C₂ является областью частично деминерализованного/дезорганизованного дентина, образовавшегося в результате использования как кислот, входящих в состав дентин-кондиционера, так и лазерного излучения.

Что касается третьего кластера C₃, то анализ данных показывает, что в этой зоне расположен слой смазанного дентина, появившегося в результате формирования полости в зубе с использованием лазерного излучения. Для удаления смазанного дентина использовали дентин-кондиционер, имеющий в своем составе предельные и непредельные кислоты. Однако, как следует из анализа полученных данных, спектральные особенности смазанного дентина проявляются в кластерах C₂ и C₃ у образцов I типа (см. рис. 2, а).

В зоне интерфейса, совпадающей с четвертым кластером C₄, присутствуют адгезив и стоматологический материал. Дифференциация химического состава в этой области, выполненная на основе спектральных данных, показывает, что на границе с LTD располагается тонкий слой адгезива 2—4 мкм. По мере удаления от границы между C₃ и C₄ вклад адгезива падает, а вклад использованного стоматологического материала DyractXP возрастает. Тщательный анализ данных показал, что при создании интерфейса I типа адгезив смешался со стоматологическим материалом. Остатки слоя смазанного дентина не позволили адгезиву проникнуть в дентинные канальцы. Этот факт также подтверждается отсутствием в кластерах C₂ и C₃ характеристического отклика от биопраймера.

Что касается образцов II типа, то крайние кластеры у этого интерфейса представляют собой область здорового дентина (кластер C₁) и коммерческого материала DyractXP (кластер C₆; см. рис. 2, б). Переходная область между C₁ и C₆ содержит четыре кластера. Кластер C₂, примыкающий к зоне здорового дентина, является областью частично дезорганизованного дентина. Сравнение ИК-спектров кластеров C₂ для образцов I и II типа показывает, что органический матрикс в этой зоне у образцов II типа изменен не так сильно, как в аналогичной области образцов I типа. Выполненная при создании биоинтерфейса (образцы II типа) дополнительная обработка раствором, содержащим оксид кальция и щадящее (мягкое) травление комплексом органических кислот, входящих в состав модифицированного дентин-кондиционера, позволили эффективно убрать компоненты смазанного дентина и раскрыть дентинные канальцы. Появление узкой зоны (1—2 μ) в переходной области биоинтерфейса и соответствующей кластеру C₃ — результат мягкого травления поверхностности дентина с использованием дентин-кондиционера и проникновения компонент биопраймера в ткани дентина.

Кластер C₄ содержит отклик от компонент биопраймера и модифицированного адгезива, в состав которого был введен карбонатзамещенный наноразмерный гидроксиапатит. Кластер C₅ является областью, в которой проявляются особенности только модифицированного адгезива.

Известно, что с использованием данных ИК-спектроскопии может быть определена степень превращения используемого адгезивного материала при полимеризации [19]. Для этого достаточно определить соотношение интенсивностей поглощения до процесса полимеризации и после него колебаний (C=C)/(C—C). Расчет был выполнен для 10 образцов адгезива и модифицированного адгезива для определения средней величины и стандартного отклонения. Расчет показывает, что в случае использования коммерческого адгезива BisGMA доля неполимеризованных связей находится на уровне 22,0±1,4%, что совпадает с аналогичным расчетом, представленным для адгезива на основе Bis-GMA/HEMA из работы U. Daood и соавт. [19]. В то же время для модифицированного (с использованием nano-c-Hap) адгезива эта величина находится на уровне 16,8±1,7%. Исходя из спектральных данных аналогичный расчет был выполнен для кластера C₅ образцов II типа, у которых в данной зоне расположен модифицированный адгезив. Расчет показывает, что доля неполимеризованных связей в данной области биомиметического интерфейса находится на уровне 18,9±1,6%, что сопоставимо с результатами для модифицированного адгезива.

Использование трехкомпонентной коммерческой бондинговой системы (образцы I типа) приводит к формированию минимального числа зон интерфейса и, как показывает эксперимент, не гарантирует формирования химически и структурно однородной границы раздела между дентином, адгезивом и стоматологическим композитом. Анализ показывает, что компоненты адгезива не проникают в глубь дентина. Такая ситуация наблюдается по всей границе гибридного слоя в области деминерализованного/дезорганизованного дентина, что отражается на форме кластеров C₂ и C₃ (см. рис. 2, а). Этот результат совпадает с данными работы Q. Ye и соавт. [4], в которой исследовали взаимодействие стоматологического материала с дезорганизованным дентином. Причиной нарушения формирования интерфейса для образцов I типа может служить слой смазанного дентина, образованный в результате лазерной аблации. Как было показано в работах Q.-T. Le и соавт. [20], использование лазерного излучения для препарирования полости в дентине приводит к образованию дезорганизованного слоя, в котором может содержаться аморфный фосфата кальция [20]. Данный слой образован в подповерхностной области и для формирования качественного интерфейса должен быть удален. Известно, что применение различных протравливающих праймеров позволяет удалить смазанный слой и раскрыть дентинные канальцы [1, 3, 20]. Однако использование активных кислот зачастую ведет к формированию толстого слоя деминерализованного дентина [16, 17, 20], а также к ухудшению характеристик интерфейса [16]. Согласно инструкции для коммерческой бондинговой системы, использованной для подготовки образцов I типа, смазанный слой дентина должен удаляться при однократном нанесении дентин-кондиционера, содержащего малые концентрации (до 12%) предельных и непредельных полифункциональных органических кислот. Проведенный нами анализ показывает, что однократная обработка кондиционером не позволила качественно удалить смазанный слой, а компоненты биопраймера не проникли внутрь дентина. В итоге у образцов I типа качественный гибридный слой не образовался.

Пошаговое препарирование дентина (образцы II типа) с использованием модифицированного полярными аминокислотами дентин-кондиционера и обработки кальциевой щелочью демонстрирует формирование менее деминерализованной и дезорганизованной области в дентине (Кластер C₂; см. рис. 2, б), чем в случае образцов I типа. Это, в свою очередь, отражается на качестве интерфейса. Последующее применение модифицированного набором полярных аминокислот праймера дополнительно способствовало раскрытию дентинных канальцев и проникновению компонент биопраймера внутрь дентина с образованием более глубокого переходного гибридного слоя.

Известно, что включение реминерализационных агентов или веществ с антибактериальными функциями, в адгезивные системы является тем фактором, который позволяет формировать гибридный интерфейс на основе полимера, коллагена и смолы, замещающий нативную ткань дентина на границе раздела дентин/адгезив [14, 21]. Такой подход дает положительные результаты, позволяя сформировать стабильные связи между адгезивом и дентином. Более того, модификация BisGMA адгезива с использованием нанокристаллического карбонатзамещенного гидроксиапатита, имеющего структурную и морфологическую организацию, аналогичную природному апатиту зубной ткани, ведет к увеличению степени превращения используемого адгезивного материала при полимеризации.

Заключение

С использованием многомерного кластерного анализа массива спектральных данных инфракрасного микрокартирования, реализованного с использованием оборудования Австралийского синхротрона, показаны различия при формировании гибридного интерфейса дентин/адгезив/стоматологический материал в условиях щелочной среды при однократной и многократной обработке полости компонентами бонда, в том числе с использованием биомиметического подхода.

Использование двухэтапной обработки смазанного слоя дентина раствором слабоконцентрированных (до 12%) предельных и непредельных полифункциональных органических кислот (малеиновой, полиакриловой и лимонной) позволяет максимально сохранить ткани дентина и эффективно удалить смазанный слой.

Установлено, что для сформированного нами биомиметического гибридного слоя характерен химически однородный состав по глубине и ширине. С использованием биомиметической стратегии и нанокристаллов карбонатзамещенного гидроксиапатита в качестве наполнителя универсального адгезива может быть достигнуто необходимое сопряжение на границе с дентином без нарушения процессов полимеризации, что должно обеспечить наилучшие показатели интеграции стоматологического композита с дентином.

Финансирование. Работа поддержана грантом Российского научного фонда №21-15-00026.

Благодарности. Часть этого исследования была проведена с использованием канала инфракрасной микроскопии (IRM) на Австралийском синхротроне, в связи с чем авторы благодарны Др. J. Vongsvivut за техническую поддержку исследований.

Авторы заявляют об отсутствии у них конфликта интересов.