Рецессивный дистрофический буллезный эпидермолиз (РДБЭ) — одна из наиболее тяжелых инвалидизирующих форм буллезного эпидермолиза, при которой генетический дефект в гене COL7A1 приводит к дефициту коллагена VII типа — основного компонента внеклеточного матрикса и связующих фибрилл, обеспечивающих поддержание целостности кожи [1]. Наиболее типичным проявлением эпидермолиза является образование на коже и слизистых оболочках геморрагических пузырей при небольшой механической нагрузке и даже спонтанно [1, 2]. После разрушения покрышки пузыря возникает рана, заживление которой сопровождается образованием незрелой фиброзной ткани и патологическим рубцеванием. Это приводит к характерной клинике заболевания: деформации конечностей, стриктурам пищевода, а в конечном итоге к возникновению плоскоклеточного рака кожи, являющегося основной причиной преждевременной смерти больных с РДБЭ [2—4]. В челюстно-лицевой области патологическое рубцевание проявляется прогрессирующей микростомией, ограничением открывания рта и анкилоглоссией, что затрудняет гигиенический уход за зубами и их лечение, а также влияет на полноценность функций глотания и речи [5—7].

Механизмы патологического фиброза при РДБЭ напрямую связаны с хронизацией раневого процесса. Хронические раны — всегда раны с пролонгированной фазой воспаления, так как разрешение воспаления за счет активации макрофагального ответа является необходимым условием для перехода в стадию заживления. Однако у пациентов с РДБЭ отсрочка заживления связана с несколькими генетически обусловленными факторами:

1. Задержка миграции кератиноцитов и фибробластов.

2. Дерегуляция сигнального пути трансформирующего фактора роста β (transforming growth factor β, TGF-β), нарушающая баланс синтеза и деградации внеклеточного матрикса.

3. Повышенная концентрация гранулоцитов и макрофагов, в том числе за счет повторных травм легко повреждающейся кожи и слизистых [2].

Дополнительным барьером для разрешения воспаления является персистирующая бактериальная инфекция [8, 9]. Известно, что у пациентов с РДБЭ регистрируют повышенную колонизацию кожи и носовых ходов патогенными и условно-патогенными микроорганизмами, прежде всего S. aureus и Ps. aeruginosa [10]. Микроорганизмы при хронизации ран способны образовывать биопленки (то есть демонстрируют кооперацию и синергию подобно бактериям зубной бляшки), при этом в ранах на коже бактериями-инициаторами биопленки служат как раз S. и Ps. aeruginosa [12—15].

Повышенное количество микроорганизмов на коже больных РДБЭ частично объясняется наличием открытых ран. Сравнение микрофлоры ран у больных с РДБЭ и другими состояниями, ассоциированными с незаживающими ранами, свидетельствует о наличии у первых особых факторов, способствующих снижению у них антимикробного иммунитета [1, 11]. Коллаген VII типа в лимфоидной ткани не только является составным элементом лимфоидного матрикса, но и обеспечивает физическую ретенцию и правильную ориентацию LCCL-домена белка кохлина в просвете лимфатических путей, тем самым играет важную роль в поддержании антибактериального иммунитета за счет активации B-лимфоцитов [1]. Дефект оси коллаген VII типа кохлин приводит к нарушению выработки макрофагами интерлейкина-6 и снижению B-клеточного ответа на инвазию микроорганизмов [1].

Микробный фактор, таким образом, поддерживает воспаление и играет важную роль в отсрочке заживления ран у больных РДБЭ, тем самым усугубляет явления патологического фиброза. Более того, последние работы выявляют роль повышенной колонизации ран микроорганизмами на коже в возникновении рака кожи. Бактериальное обсеменение незаживающих ран у больных РДБЭ приводит к повышению экспрессии белка HMGB-1 кератиноцитами. Этот белок запускает нетоз (англ NETosis, от Neutrophil extracellular traps — вид программируемой клеточной гибели нейтрофилов), направленный на борьбу с бактериальной инфекцией, но в тоже время способный вызвать повреждение окружающих тканей и влиять на процессы, способствующие возникновению рака кожи [3].

Все исследования по изучению микробной колонизации ран у больных с РДБЭ, проводили на коже, причем большинством авторов не выявлено корреляции роста числа микроорганизмов и их видового разнообразия с возрастом и прогрессией заболевания.

В настоящее время для характеристики микробиоценоза отдельных органов и систем (кишечник, кожа, рот и т.д.) введен термин микробиота, под которым понимают сообщество различных микроорганизмов в среде обитания и имеющих важное значение для иммунологического, гормонального и метаболического гомеостаза организма хозяина.

Микробиоту слизистой оболочки рта у пациентов с РДБЭ до сих пор не изучали, поэтому целью нашего исследования была оценка состояния микробиоты слизистой оболочки рта у детей с РДБЭ, а также выявление ее возможной возрастной динамики.

Материал и методы

Обследовано 77 детей с РДБЭ в возрасте 3—18 лет (средний возраст 9,5±3,6 года) и 27 здоровых детей 4—18 лет (9,8±4,1), составивших группу контроля. Материал для исследования забирали натощак с элементов поражения слизистой оболочки рта с помощью специального тампона с транспортной средой (Amies, Испания). Материалом для исследования у детей контрольной группы служила ротовая жидкость, полученная путем смыва слизистой оболочки рта 10,0 мл фосфатного буферного раствора. Рост факультативных микроорганизмов на селективных средах учитывали через 24, 48 и 72 ч инкубации (37 °C и 30 °C) с последующей идентификацией на автоматическом бактериологическом анализаторе MicroScan WalkAway (Simens, США).

Статистический анализ проводили на персональном компьютере с использованием программы «SPSS» (v13.0. for Windows). Статистическую обработку результатов выполняли стандартными параметрическими и непараметрическими методами. Для проверки достоверности различий значений признаков в группах использовали тест «хи-квадрат». Различия считались статистически значимыми при p<0,05 (95% ДИ).

Результаты и обсуждение

Обнаруженные в ходе анализа виды микроорганизмов, выделенных с элементов поражения слизистой оболочки рта у детей с РДБЭ и неизмененной слизистой оболочки у здоровых детей (группа контроля) представлены в таблице.

Представители микробиома слизистой рта у детей с РДБЭ и здоровых детей

Различия в видовом составе микроорганизмов у здоровых детей и детей с РДБЭ очевидны. Это прежде всего связано с различным состоянием слизистой оболочки рта у пациентов с РДБЭ и здоровых детей. У детей с РДБЭ во рту имеются длительно незаживающие раны, тогда как в контрольной группе у детей была неизмененная слизистая оболочка. У больных детей бросается в глаза значительно большее число видов патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, колонизирующих раневые поверхности. Эта тенденция сохраняется и для представителей нормальной микрофлоры рта. Кроме того, у детей с РДБЭ обнаружены повышенные, клинически значимые титры (от 10³ КОЕ/см³ до 10⁸ КОЕ/см³) условно-патогенных и патогенных микроорганизмов и грибов рода Candida. Среди них лидируют C. albicans (обнаружена у 40,3% детей), S. aureus (23,4%), E. cloacae (9,1%) и другие представители семейства энтеробактерий (10,4%). У здоровых детей из патогенных видов обнаружена только C. albicans (у 26% детей, рис. 1).

Рис. 1. Наиболее типичные представители условно патогенных и патогенных микроорганизмов и Candida albicans на слизистой рта у детей с РДБЭ и здоровых детей.

Наше исследование показало статистически значимый рост частоты встречаемости и титра патогенных микроогранизмов у детей с РДЭБ с возрастом. У 3—6 летних (19 детей) хотя бы один условно-патогенный или патогенный вид обнаруживали в 21,1% случаев, у 7—10 летних (21 ребенок) — в 71,4%, у детей старше 10 лет — в 91,9% (p=0,001; рис. 2).

Рис. 2. Количество случаев с обнаружением различных видов условно патогенных и патогенных микроорганизмов на слизистой рта у детей с РДБЭ разного возраста.

При исследовании микробиоты кожных ран у детей РДБЭ, проведенном I. Fuentes и соавт. (2018), возрастная динамика обнаружена не была [8—10, 16]. Вероятно, это связано с тем, что основная масса пациентов в обследуемых когортах была представлена подростками и молодыми взрослыми и лишь 2 пациента в исследовании были младше 10 лет [8].

Возраст между 7 и 10 годами, по всей вероятности, является критическим для прогрессии болезни у детей с РДБЭ. В этот период нами обнаружен значительный рост бактериальной нагрузки, что выражалось не только большей частотой обнаружения, но и более высокими титрами условно-патогенных и патогенных видов микроорганизмов, выделенных у этих пациентов. Их концентрация составляла от 10³ КОЕ/см³ до 10⁷ КОЕ/см³ (от lg 3,5 до lg 7,8). Такие результаты отмечены только у детей старше 8 лет (рис. 3).

Рис. 3. Титры Candida albicans, Staphilococcus aureus и Enterobacter cloacae на слизистой рта у детей с РДБЭ разного возраста.

Наши предыдущие исследования говорят о том, что на возраст 8—10 лет приходится ухудшение и клинической картины заболевания за счет прогрессирующих явлений фиброза [7]. Возрастающая бактериальная нагрузка, с одной стороны, является следствием нарастающих нарушений компонентов антибактериального как локального, так и общего иммунитета [1], а, с другой, способствует хронизации раневого процесса и тем самым усугубляет образование патологической рубцовой ткани.

У больных РДБЭ с преимущественно кожными поражениями наиболее часто обнаруживают S. aureus [8—10], который, как уже доказано в экспериментальных моделях и in vivo, наряду с Ps. aeruginosa является инициирующим микроорганизмом для образования раневой биопленки [12, 14—17]. Это характерно не только для больных с РДБЭ. K. Gjødsbøl и соавт. (2013) обнаружили, что данные микроогранизмы превалируют и способны образовывать биопленку на поверхности кожных язв, возникающих на фоне венозной недостаточности.

Согласно исследованию I. Fuentes и соавт. (2018), по мере существования раны на коже у пациентов с РДБЭ микробный пейзаж претерпевает значительные изменения. Число микробных видов, выделенных с поверхности ран, снижается, а стафилококки становятся основными возбудителями, поддерживающими воспалительный процесс.

Наше исследование также отчасти подтверждает этот факт. Превалирующим видом в микробиоте рта у детей с эпидермолизом были грибы рода Candida, что, по-видимому, отражает общую высокую частоту встречаемости данного вида (он высевался и у 26% здоровых детей в клинически значимых, но все же меньших по сравнению с РДЭБ концентрациях) (рис. 1, 3). C. albicans занимает значимую экологическую нишу у детей с РДЭБ на фоне дефекта локального иммунитета. Нами отмечено, что частота встречаемости и титры S. aureus нарастали с возрастом и почти всегда вытесняли собой C. Albicans и E. cloacae (рис. 3), то есть прослеживается тенденция аналогичная таковой в кожных ранах.

S. aureus встречался в раневом отделяемом лишь у 5,3% 3—6-летних детей, 23,8% 7—10 летних и 32,4% детей старше 10 лет с РДЭБ. Вероятно, его обнаружение свидетельствует о хроническом течении раневого процесса (а с возрастом на фоне прогрессии заболевания хронические раны на слизистой рта у детей с РДЭБ возникают все чаще) и является неблагоприятным прогностическим признаком.

Согласно исследованию отделяемого трофических кожных язв на фоне сахарного диабета, проведенного J. Kim и соавт. (2020), нарастание оксидативного стресса при хронизации раневого процесса значительно изменяет состав микробиоты. Для хронических ран без тенденции к заживлению характерно появление микроорганизмов, формирующих раневую биопленку, в частности Ps. aeruginosa, E. cloacae и Acinetobacter spp. Появление Acenitobacter spp. (редко) и особенно E. cloacae характерно для детей с РДЭБ старшей возрастной группы (последний не встречался у детей 3—6 лет, но высевался у 9,5% детей 7—10 лет и 13,5% детей старше 10 лет с РДЭБ). Таким образом, данные виды микроорганизмов также могут служить индикаторами хронизации раневого процесса у детей с РДЭБ.

Ps. aeruginosa в нашем исследовании встречалась одинаково редко во всех возрастных группах. Это отличает раны на слизистой оболочке рта от ран на коже у пациентов с РДЭБ, так как в кожных ранах это типичный инициатор образования биопленки наряду со S. aureus [13]. Данный возбудитель характеризует собой особо агрессивно растущие раневые биопленки [18], поэтому его появление в ране может свидетельствовать о более тяжелом течении заболевания. В нашем исследовании он был выявлен только у 4 из 77 детей с РДЭБ (причем один ребенок младше 6 лет). Это свидетельствует о том, что типичный для хронических кожных ран, в том числе у пациентов с РДЭБ, микроорганизм далеко не типичен для ран на СОР, и потому клиническое и прогностическое значение его обнаружения пока неясно.

Заключение

Для детей с РДЭБ характерна значительная бактериальная нагрузка на СОР с превалированием высоких титров C. albicans, S. aureus и E. cloacae. Частота появления и титры данных видов нарастают с возрастом и значимо отличаются у детей 3—6 и 7—10 лет, что коррелирует с прогрессией заболевания и нарастанием явлений патологического фиброза. Высокая степень колонизации условно-патогенными и патогенными видами микроорганизмов свидетельствует о нарушении антибактериального иммунитета. По мере хронизации раневого процесса микробный состав раневого отделяемого меняется: повышается частота встречаемости S. aureus и E. cloacae, способных образовывать биопленки в хронических ранах.

Обнаружение данных микроорганизмов является неблагоприятным прогностическим признаком и свидетельствует о затяжном раневом процессе, способствующем образованию патологической рубцовой ткани. Профилактика хронических ран у детей с РДЭБ, по сути, является и профилактикой фиброза, сопровождающегося микростомией, ограничением открывания рта, микроглоссией. Лечение пациентов может продвигаться в нескольких направлениях, среди которых немаловажное место занимает нормализация локального иммунного ответа и применение специфических антимикробных препаратов, в том числе бактериофагов, способных уменьшить бактериальную нагрузку на раны СОР, тем самым устранив одно из препятствий к заживлению.

Исследование выполнено при поддержке благотворительного фонда «Дети-бабочки».

The study is supported by the charitable foundation «Butterfly Children».

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.