Динамика остеогенетического процесса, вызванного инокуляцией аутогенных мезенхимальных стволовых клеток, выделенных из жировой ткани

Актуальность применения клеточных технологий в клинической практике не вызывает сомнений, поскольку в перспективе, по-видимому, сулит получение новых средств и методов лечения многих, неизлечимых прежде заболеваний, таких как, например, болезнь Альцгеймера, цирроз печени, ишемическая болезнь сердца и многие другие.

Для реализации этой перспективы потребуется дальнейшее и углубленное исследование сложных механизмов генетически детерминированных механизмов развития и жизнедеятельности клеток с учетом действия на них в условиях целостного организма адаптивных и компенсаторных механизмов [5].

С этой точки зрения следует признать чрезвычайно важным ставшее общепризнанным представление о существовании эффекта торможения клеточного деления и истощения клеточных линий во взрослом организме животных и человека (один из ведущих механизмов старения организма).

На клеточном уровне реализация этого эффекта обусловлена лимитированием числа делений клетки ферментом теломеразой, необходимой для репликации ДНК [6]. Поскольку этот механизм может работать и при применении клеточных трансплантатов в лечебных целях, некоторыми исследователями ставится вопрос о необходимости известной осторожности при разработке методов лечения, основанных на клеточных технологиях, и их внедрении в клиническую практику.

О том, насколько важно раскрыть механизмы, лежащие в основе эффектов инокуляции клеток-предшественников, свидетельствует следующий пример.

«При пересадке дофаминергических нейронов от поздних эмбрионов (6—9 нед гестации) в ткань мозга, которая, как известно, окружена гемато-энцефалическим барьером, положительная динамика у больных с болезнью Паркинсона обычно нарастала только в течение первых 3—6 мес после операции (период развития пересаженных нейронов и установления их связей с мозгом больного) и затем шла на убыль за счет постепенной дегенерации и гибели трансплантированных нейронов. Было высказано предположение, что гибель трансплантированных нейронов при этом может быть связана с отсутствием в мозге взрослого реципиента микросреды, обеспечивающей их выживание и развитие: отсутствует выработка определенного спектра ростовых нейротрофических факторов эмбрионального или плацентарного происхождения» [3]. Мы сочли необходимым процитировать приведенный текст, чтобы показать, что исследователям приходится в клинике сталкиваться с феноменом, которому они не находят должного объяснения. А ведь в данном случае клиницисты столкнулись с феноменом «лимита клеточных делений».

Несомненно, что дальнейшее и всестороннее исследование механизмов (в том числе — молекулярных) клеточного деления, а также поиск способов активного воздействия на них в лечебных целях сегодня крайне актуальны.

Проблема клеточного деления как область теоретических и прикладных научных исследований представляется особенно важной, потому что один из ее практических аспектов тесным образом связан с задачей разработки методов борьбы с феноменом иммортализации клеток, присущей злокачественному росту, который возникает в результате нелимитированной выработки теломеразы, что обусловливает непрекращающиеся циклы репликации ДНК на теломерах. Решение этой проблемы признается сегодня одной из актуальнейших задач теоретического и прикладного разделов медицинской науки [7].

Анализ литературы показывает, что исследование указанных проблем осуществлялось преимущественно invitro. В то же время следует признать, что корреляции различных эффектов, в том числе когда речь идет об опухолях, исследуемых invivo иinvitro, оказываются весьма сомнительными. Можно сослаться, в частности, на данные исследования Е.А. Рогозина [2].

Учитывая вышесказанное, в настоящей работе была поставлена цель в опытах на крысах:

— исследовать остеогенетическую эффективность МСК из аутогенной жировой ткани в разные сроки после их инокуляции;

— выявить, используя гистоморфологический метод, конкретные процессы жизненного цикла костной ткани, подверженные тем или иным изменениям под влиянием МСК, введенных в область экспериментального воздействия;

— оценить длительность остеостимулирующего эффекта воздействия аутогенных МСК из жировой ткани, инокулированных в пространство между костным аутотрансплантатом и материнской костью (нижняя челюсть — НЧ) подопытных животных, определив таким образом по показателям остеогенетической активности в зоне экспериментального воздействия длительность сохранения активных клеток в популяции инокулированных МСК.

Экспериментальное хирургическое вмешательство проводили в 2 этапа.

1-й хирургический этап. Производили забор аутотрансплантата из правой большеберцовой кости под наркозом: кетамин с ксилазином (1:1 по объему в 1 шприце) из расчета 0,15 мл препарата на 100 г массы животного. Проводили разрез по передней поверхности голени от дистальной части симфиза коленного сустава над большеберцовой костью длиной приблизительно 1,5 см. Рассекали футлярно-надкостничную перемычки верхней трети кости. Скелетировали участок кости 2×2 мм фрезой (охлаждение физиологическим раствором) на глубину 1,5 мм. Выпиливали участок кости (аутотрансплантат). Костный дефект пломбировали хирургическим воском Bonewax фирмы «Ethicon».

Аутотрансплантат помещали в стерильный физиологический раствор. Рану ушивали (Викрил 5/0). Гемостаз — по ходу операции.

2-й хирургический этап. Производили пересадку свободного аутотрансплантата с большеберцовой кости на наружную поверхность тела и ветви нижней челюсти с фиксацией титановым микровинтом (длиной 5 мм, диаметром 1,2 мм).

Разрезали кожу и подкожную жировую клетчатку по краю тела НЧ, тупым путем раздвигая мышцы и сосуды; осуществляли доступ к поверхности тела и ветви Н.Ч. Кость скелетировали, производили остеоабразию площадью 3×3 мм. Создавали перфорационное отверстие в кости НЧ и аутотрансплантате (охлаждение физиологическим раствором). Аутотрансплантат фиксировали титановым винтом. Рану ушивали (Викрил 5/0). Антибиотик Байтрил 5% по 0,1 мл вводили внутримышечно дважды после операции из расчета 10 мг/кг.

Выделение МСК жировой ткани и культивирование МСК жировой ткани.Процедурывыделения и культивирования МСК жировой ткани описаны [4]. Количество МСК на 1 введение на крысу составляло 3,5—6,7·10⁶ в 0,4 мл физиологического раствора.

Эксперимент был проведен на 40 крысах-самцах линии Вистар массой 200—220 г. Животных разделили на две равные группы: основную, в которой животным в пространство между костным аутотрансплантатом (фрагмент большеберцовой кости) и материнской костью (НЧ) инокулировали МСК, и группу сравнения, в которой животным МСК не вводили.

Способ введения МСК.1-е введение — в день операции путем инъекции в область операции, 2-е введение — на 10-е сутки после операции, область операции обкалывали в 4 точках.

Методика гистологического исследования. Из каждого костного блока, включающего в себя костный аутотрансплантат и фрагмент материнской кости, готовили после декальцинации в 25% Трилоне Б и заливки в парафин срезы толщиной 8 мкм, которые окрашивали гематоксилином и эозином либо по Вейгерту пикрофуксином и железным гематоксилином Вейгерта.

Из каждого тканевого блока готовили по 4 среза. Для исследования отбирали каждый 10-й срез. Таким образом, расстояние между срезами составляло порядка 50 мкм. Число исследованных срезов на каждую точку наблюдения составило 20. Такой дизайн морфометрии обеспечивал репрезентативность исследованного материала по группам и срокам экспериментов, позволял выявить с высокой степенью достоверности корреляции между актом инокуляции МСК в область экспериментального воздействия и морфологическими проявлениями эффектов от введения МСК. Вкупе с данными анализа в группе сравнения полученные данные послужили основанием для заключения об остеогенном эффекте инокуляции аутогенных МСК в пространство между аутокостным трансплантатом и материнской костью.

Сопоставляли интенсивность образования нового костного вещества (фиброретикулярная кость) в двух группах — основной, животным которой в область экспериментального воздействия вводили МСК из аутогенной жировой ткани, и в группе сравнения (МСК не вводили).

Сроки наблюдения: 21; 60; 120 и 180 сут.

Гистоморфометрический анализ проводили в соответствии с рекомендациями Г.Г. Автандилова [1].

В гистологических препаратах определяли долю площади (%), занимаемую нижеследующими тканевыми структурами:

— вновь образованное костное вещество — фиброретикулярная костная ткань;

— зрелая пластинчатая костная ткань;

— фиброзная или клеточно-волокнистая соединительная ткань.

Тип тканевых структур выбирали, исходя из следующих соображений: во-первых, изучение динамики образования фиброретикулярной костной ткани позволяло количественно определить остеогенетическую активность введенных в область экспериментального воздействия МСК; с другой стороны, по показателям интенсивного новообразования костного вещества в разные сроки эксперимента мы полагали возможным судить о длительности сохранения в области экспериментального воздействия инокулированных МСК.

В процессе анализа статистических показателей были произведены процедуры, позволившие определить доли площади (%), занимаемой каждой из 3 тканевых структур: фиброретикулярной костной тканью; зрелой пластинчатой костной тканью; фиброзной или клеточно-волокнистой соединительной тканью. При сопоставлении полученных величин за их значимое различие принимали t≤0,001.

Все статистические процедуры производили в аппарате программы Excel 2003 по методу Стьюдента. Статистическую значимость различий или вероятность принадлежности к различным числовым массивам (или наоборот) определяли с помощью t-теста (ТТЕСТ) в пакете статистических исследований Exel 2003. Во всех случаях статистические значения характеризовались нормальным распределением.

Анализ динамики долей тканевых структур показал, что в пространстве между костным аутотрансплантатом и материнской костью (НЧ) и в них самих развиваются процессы, которые с высокой степенью достоверности могут рассматриваться как эффект воздействия МСК (статистические показатели по всем группам наблюдений представлены в таблице).

Так, в ранние сроки эксперимента (21-е и 60-е сутки) в указанной области наблюдалось интенсивное формирование фиброретикулярной костной ткани (рис. 1, рис. 2, см. таблицу). При этом активный остеогенез отмечался как в основной группе, так и в группе сравнения. Однако в основной группе площадь, занимаемая фиброретикулярной костной тканью, была значимо больше, чем в группе сравнения (t≤0,001); см. рис. 1. Относительно высокая интенсивность костеобразования, отмеченная у животных группы сравнения на 21-е сутки, была обусловлена непосредственной и естественной регенераторной реакцией костной ткани на травматическое воздействие. При этом она была значимо менее выраженной, чем у животных основной группы. В основной группе, начиная с 21 сут, наблюдались стабильно высокие значения этого показателя, которые сохранялись вплоть до 120 сут (см. рис. 2).

Однако к сроку 180 сут площади, занятые незрелыми костными структурами фиброретикулярного типа,резко сокращались (t≤0,001); см. рис 1. При этом костная ткань аутотрансплантата, прежде гиперплазированная под влиянием активных МСК, к сроку 180 сут подвергалась частичной, иногда очень выраженной резорбции (рис. 3), в ней нарастал удельный вес полей фиброзной и клеточно-волокнистой соединительной ткани (t≤0,001).

Что касается зрелой пластинчатой кости, имеющей остеонное строение, то в сроки 120 и 180 сут ее показатели значимо нарастали относительно 60-х суток (t≤0,001).

В группе сравнения во все сроки наблюдения между костным аутотрансплантатом и материнской костью располагалась широкая зона фиброзной соединительной ткани (рис. 4).

Таким образом, судя по динамике доли площадей тканевых структур 3 типов в пространстве между аутотрансплантатом и материнской костью, куда в основной группе экспериментов инокулировали аутогенные МСК, полученные из жировой ткани, происходила индукция образования нового костного вещества, особенно выраженная в сроки 21—60 сут. Об этом, в частности, свидетельствует статистически значимое превышение интенсивности новообразования костного вещества в основной группе относительно этого показателя в группе сравнения. Интенсивность костеобразования в группе сравнения была относительно высокой лишь на 21-е сутки, что объяснялось непосредственной и естественной репарационной реакцией остеогенетических элементов костной ткани. Тем не менее в основной группе показатели костеообразовательной активности на 21-е сутки были значимо выше, чем в группе сравнения (см. таблицу и рис. 1).

В целом в области инокуляции МСК происходили сложные взаимосвязанные процессы, отражающие как остеогенетический потенциал инокулированных МСК, так и особенности их характеристик, в частности очевидную гетерогенность этой клеточной популяции по продолжительности жизни, что в значительной мере соответствует концепции L. Hayflick, P. Moorhead, которые постулировали гетерогенность популяций стволовых клеток, связанную с нарастанием числа дефектных репликаций, сопровождающихся одновременно сокращением на концах хромосом длины теломеров, чем обусловлены процессы старения, в том числе стволовых клеток [8],

Можно предположить, что пул МСК в отдаленные сроки (после 120 сут.) при отсутствии пополнения их рядов извне истощался в результате созревания определенной части этих клеток (здесь и далее — см. рис. 1). О правомерности такой гипотезы (и высокой вероятности ее соответствия реальности) свидетельствовало также значимое возрастание в сроки 120 и 180 сут, по сравнению с 60-ми сутками, доли зрелой пластинчатой кости (t≤0,001). Следует предположить, что процесс ремоделирования имел обратную сторону — истощение пула введенных в пространство между материнской костью и аутотрансплантатом МСК и прекращение соответственно в период после 120 сут (к 180 сут) эффекта индукции остеогенеза, вызванной МСК. В литературе описываются и обсуждаются отдельные звенья механизмов, регулирующих процесс ограничения числа клеточных делений на теломерах [14]. Это явление связывают с отсутствием теломеразной активности на концах хромосом теломеров, в результате чего часть клеток по мере осуществления митозов выпадает из циклов репликации ДНК [14]. Кстати, такие же эффекты могут наблюдаться в митохондриальных ДНК, что неминуемо включает механизмы апоптоза клеток [12].

Заслуживает внимания динамика показателей долей площадей, занимаемых в группах экспериментальных наблюдений соединительной тканью. На рис. 1 видно резкое, скачкообразное возрастание доли площадей, занятых соединительной тканью в основной группе в срок 180 сут опыта. Такая динамика этого показателя отражает процессы резорбции костного вещества с его замещением соединительной тканью, что наблюдалось на значительных по протяженности участках аутотрансплантата в этот срок (t≤0,001). В гистологических препаратах этому процессу соответствовали крайне выраженные картины деградации костного вещества, что выражалось в образовании обширных резорбционных дефектов в костных блоках (см. рис. 3).

В основной группе, животным которой в область экспериментального воздействия вводили МСК, до 120 сут опыта площади, занимаемые соединительной тканью, были минимальными; напротив, в группе сравнения, в которой МСК не вводили, наблюдалось значимое преобладание доли площади, занимаемой фиброзной либо клеточно-волокнистой тканью (см. рис. 1, 4), что по-видимому, объясняется дефицитом трофического обеспечения. Недаром в группе сравнения наблюдались изъеденность краев костного аутотрансплантата, а также дегенерация и декомпозиция пристеночно расположенных клеток и снижение их количества (см. рис. 4). В условиях дефицита трофического обеспечения обычным является приоритетное развитие соединительной ткани [11]. Эти изменения, в общем-то альтеративного характера, свидетельствуют о том, что использованная экспериментальная модель по условиям трофического обеспечения аутотрансплантата не являлась оптимальной, что и приводило к возникновению описанных структурных проявлений альтерации в костном аутотрансплантате как в группе сравнения, так и при прекращении индуцирующего остеогенез воздействия активных МСК на фоне истощения их пула в основной группе опыта к сроку 180 сут.

Таким образом, можно заключить, что одним из клинически важных эффектов введения МСК являлось заполнение пространства между аутокостным трансплантатом и материнской костью новообразованной костной тканью, которая закономерно претерпевает вторичную перестройку и дифференциацию в процесс ремоделирования. Естественно, в эти физиологические процессы вовлекаются и введенные в пространство между материнской костью и аутотрансплантатом МСК. Интенсивность образования костного вещества de novo (фиброретикулярная кость), его значимое возрастание по сравнению с таковым в группе сравнения полностью отражает остеогенетический потенциал инокулированных МСК.

Вместе с тем в сроки после 120 сут (к 180 сут) наблюдалось значимое снижение площади, занимаемой фиброретикулярной костной тканью при одновременном значимом возрастании площади зрелой пластинчатой костной ткани (см. рис. 2). Этот феномен, на наш взгляд, объясняется убылью количества числа активных клеток в популяции инокулированных МСК, которая не восполняется в полном объеме после граничного числа деления ее клеток из-за генетически обусловленного запрета на деление клеток сверх ограниченного числа митозов, в результате чего происходит выпадение все большего числа клеток данной линии из пула активных остеогенных предшественников.

Приведенная интерпретация полученных нами данных совпадает с концепцией [6, 8—10, 13], находящей сегодня все больше сторонников [9, 14]. Эта концепция постулирует существование механизма, ограничивающего число делений клеток на концах хромосом (теломер) из-за отсутствия на них теломеразы. Указанный механизм играет важную роль в стабилизации процесса смены клеточных генераций, обусловливает «старениие» клеточных популяций, а также препятствует иммортализации клеток и соответственно их озлокачествлению [10].