Развитие современной медицины и, в частности, стоматологии, потребовало детального изучения и идентификации микроорганизмов, представляющих собой нормальную микрофлору (микробиоту). Известно, что микрофлора играет важную роль в формировании патологии ротовой полости и возникновении различных соматических заболеваний [1, 6]. Показано, что среди бактерий, обитающих в организме человека, много условно-патогенных, способных вызывать заболевания различной локализации [1]. Микроорганизмы, обитающие в ротовой полости человека, остаются малоизученными. Считается, что мы знаем не более 5% микроорганизмов нормальной микрофлоры [1]. Недостаточная изученность нормальной микрофлоры связана прежде всего с отсутствием методов культивирования, обеспечивающих выделение чистых культур этих микробов. Все бактерии микрофлоры существуют в виде изолированных сообществ — биопленок, что затрудняет получение и изучение их свойств известными методами [3, 5]. В число неизученных и практически неизвестных входят различные бактерии, археи, грибы и вирусы. Их присутствие обнаружилось при изучении ДНК микробиоты, когда было выявлено большое число генов, принадлежащих неизвестным бактериям [2, 3].

Цель настоящей работы — выявление и идентификация в нормальной микрофлоре ротовой полости малоизученных или неизвестных ранее аэробных условно-патогенных бактерий.

Исследована слюна людей в возрасте от 19 до 60 лет. Материал собирали в стерильные пробирки и в течение 1 ч после забора материала производили высевы. Для выделения бактерий использовались жидкие и агаризованные питательные среды: бруцелла агар, эндо, кровяной агар, агаризованная среда LВ («BioMerie», Дания).

Полученные на агаризованной среде колонии анализировали по характеру роста, морфологии и изменениям свойств среды.

Для изучения бактерий применяли окраску по Граму и световую микроскопию (микроскопы Olympus BX51TF, «Olympus Corp.», Япония). Применялась программа для компьютера ProgRes® MAC CapturePro Version 2.7.6 Jenoptic (Германия). Чистые культуры идентифицировали по биохимической активности с помощью автоматической системы Vitec-2 («BioMerie», Дания).

Использованный метод культивирования позволил получить смешанные биопленки, включающие от 2 до 8 бактерий. По своей морфологии смешанные биопленки похожи на колонии, образованные бактериями 1 вида. Интересно отметить, что чистые бактериальные культуры в использованных нами условиях в 1-м высеве из слюны практически не были обнаружены (рис. 1).

Выявленные смешанные биопленки по организации идентичны смешанным микробным сообществам, описанным нами ранее [10]. В результате пересева на разные среды удалось разделить минимальное количество смешанных биопленок. Большинство их оказались устойчивыми сообществами, которые выдерживали многократные (изучено до 10 и более) пересевы на аналогичные среды. Вместе с тем были выявлены смешанные биопленки, которые не выдерживали более 1 пересева, что ограничивало возможность их детального изучения. Образование на питательных средах большого числа разнообразных смешанных биопленок свидетельствует о существовании тесного взаимодействия между различными, неродственными бактериями. Устойчивое воспроизведение смешанных бактериальных биопленок и невозможность получения на использованных средах чистых культур указывает на выраженный мутуализм у бактерий нормальной микрофлоры. В этом типе взаимодействия каждая из бактерий дает другой какие-то факторы, которые получатель не может синтезировать сам. Очевидно, что эти факторы отсутствуют в использованных нами питательных средах.

Часть бактерий, изолированных из смешанных биопленок в виде чистых культур, которые удалось идентифицировать (с достоверностью 98—99% по биохимическим тестам), принадлежат к известным родам и видам, но не описаны или малоизвестны как представители нормальной микрофлоры ротовой полости человека. При этом данные бактерии давно известны как возбудители разных заболеваний человека.

Так, в ротовой полости обнаружен Aerococcus viridans — грамположительный микроорганизм, относящийся к возбудителям оппортунистических инфекций [8]. В число заболеваний, которые может вызвать A. viridans, входят менингиты у детей, инфекции мочевыделительной системы и эндокардиты у детей и взрослых, септический артрит и бактериемия. Известно, что эта бактерия встречается в микрофлоре кожи человека и, по некоторым данным, на слизистой верхних дыхательных путей, способна распространяться в госпиталях и считается возбудителем внутрибольничных (нозокомиальных) инфекций.

Грамотрицательная бактерия Klebsiella oxytoca известна как условно-патогенный микроорганизм, не является типичным представителем нормальной микрофлоры ротовой полости человека и относится к возбудителям оппортунистических инфекций [7]; грамположительные стафилококки — Staphylococcus epidermidis, St. hominis ssp. hominis, St. lugdunensis и St. warneri — входит в состав нормальной микрофлоры кожи человека, недавно обнаружен в ротовой полости, St. pasteuri (в слюне практически не выявлялся) относятся к возбудителям оппортунистических и нозокомиальных инфекций [9]; грамотрицательная бактерия Pseudomonas putida(рис. 2)

Из ротовой полости были также выделены микробы, которые по морфологии были похожи на известные бактерии, но по биохимической активности не могли быть достоверно отнесены к представителям известных родов и видов (Aerococcus viridans — 89%, Streptococcusepidermidis — 89%, Staphylococcus aureus — 84,8%, St. warneri — 82%, St. lugdunensis — 93%, Streptococcus mitis/S. oralis — 86%, Micrococcus luteus — 86% и некоторые другие). Бактерии, имеющие сходство (86%) с видом M. luteus, отличались от известного М. luteus характером роста (характеристики колоний), размером и формой клеток.

Практически все выделенные и идентифицированные бактерии способны вызывать гнойно-воспалительные процессы и являются потенциальными возбудителями различных поражений пульпы зуба и пародонта. Их локализация в ротовой полости указывает на потенциальную опасность для здоровья в случае распространения в организме. Носительство условно-патогенных бактерий в ротовой полости считается важным фактором развития соматических заболеваний [1, 6].

Таким образом, в ходе исследования из ротовой полости были выделены смешанные микробные биопленки, из которых были изолированы бактерии, неизвестные ранее как представители данной микробиоты.

Полученные данные позволяют по-новому оценивать такие важные процессы, как сохранение и перераспределение генов между родственными и неродственными бактериями, определение рисков формирования оппортунистических инфекций.

В результате проведенных исследований удалось получить принципиально новые данные о нормальной микрофлоре ротовой полости. Установлено, что первоначально практически все бактерии слюны людей вырастают на питательных средах в виде смешанных биопленок. Смешанные микробные биопленки, дающие исходный рост в использованных условиях, содержали от 2 до 7 разных неродственных грамотрицательных и грамположительных аэробных бактерий.

Подавляющее большинство микробов, образующих эти смешанные биопленки, не давали изолированного, независимого роста. Однако некоторые бактерии удалось получить в виде чистых культур и идентифицировать их биохимическую активность.

Таким образом, полученные данные указывают, что новые подходы к изучению состава нормальной микрофлоры, основанные на культивировании смешанных микробных биопленок, позволяют изолировать малоизвестные и неизвестные ранее бактерии микробиоты человека.