Бактерицидная активность ротовой жидкости в комплексной диагностике дисбиотических изменений слизистой оболочки рта

Ротовая жидкость является комплексным секретом. Она продуцируется 3 парами крупных (околоушной, поднижнечелюстной, подъязычной) и множеством мелких слюнных желез слизистой оболочки рта (СОР). В состав ротовой жидкости входят десневая жидкость, бактерии и продукты их жизнедеятельности, вирусы, грибы, слущивающийся эпителий и остатки пищи. В условиях покоя рН ротовой жидкости составляет 5,45—6,06, а при стимуляции повышается до 7,8. Ротовая жидкость играет ведущую роль в обеспечении целостности тканей СОР, что обусловлено ее бактерицидными свойствами, обусловленными неспецифическими и специфическими иммунологическими механизмами [9, 10]. Неспецифические факторы защиты связаны с состоянием нормальной микрофлоры, структурными особенностями СОР, защитными свойствами ротовой жидкости. Специфические факторы связаны с деятельностью Т- и В-лимфоцитов, бактерицидных протеинов (лизоцим, лактоферрин, лактопероксидаза, иммуноглобулины, муцины, агглютинины и др.) и антибактериальных пептидов (гистатины, дефензины, кателицидин) [5, 6, 8]. Специфические и неспецифические факторы защиты ротовой жидкости взаимосвязаны и находятся в состоянии динамического равновесия.

При снижении функциональной активности ротовой жидкости происходит замещение условно-патогенных микроорганизмов патогенной флорой, что способствует развитию дисбактериоза СОР различной степени тяжести [2, 7].

Цель настоящего исследования — изучение бактерицидной активности ротовой жидкости методом лазерной проточной цитометрии и использование данного метода в комплексной диагностике дисбиотических изменений СОР.

Для достижения поставленной цели в отделении заболеваний СОР ЦНИИС было проведено комплексное клинико-лабораторное обследование 37 пациентов 25—65 лет, в том числе 24 женщин и 13 мужчин.

Всем пациентам при первичном обращении проводилось микробиологическое исследование на дисбактериоз СОР по общепринятой методике. При выявленных соматических нарушениях больных консультировали соответствующие специалисты (стоматоневролог, гастроэнтеролог, эндокринолог и др.).

Пациенты были распределены на 2 группы: основную — 30 человек, у которых был диагностирован дисбактериоз СОР; в зависимости от степени его тяжести они были подразделены на 4 подгруппы: 1-я — больные с дисбиотическим сдвигом (4 человека); 2-я — с дисбактериозом I—II степени (9 человек); 3-я — с дисбактериозом III степени (11 человек) и 4-я — с дисбактериозом IV степени (6 человек). В контрольную группу включили 7 человек, обратившихся к врачу-стоматологу по поводу кариеса и его осложнений; признаков, указывающих на наличие дисбиотических изменений СОР, у них не выявлено.

Для исследования бактерицидной активности СОР мы использовали ротовую жидкость как наиболее доступную и простую в получении.

Ротовую жидкость (3—5 мл) собирали в течение 10 мин натощак без предварительных гигиенических мероприятий. Полученную пробу центрифугировали в течение 20 мин при 1500 g для удаления посторонних включений и при необходимости длительного хранения замораживали при температуре –20 °С до момента постановки реакции.

Общую бактерицидную активность ротовой жидкости оценивали с помощью лазерной проточной цитометрии. Результаты данного метода исследования являются критерием тяжести патологического процесса [3].

Реакцию ставят в 96 луночном круглодонном планшете. К 90 мкл ротовой жидкости добавляют 90 мкл флюоресцеин-5-изотиоцианата (ФИТЦ) («Molecular Probe») и вносят суточную культуру Candida albicans (10 млн/мл) в течение 3 и 24 ч при 37 °С. После инкубации бактерии осаждают центрифугированием при 1000 g в течение 10 мин и ресуспендируют в 200 мкл пропидиума йодида (ПИ) (2,5 мг/мл) на фосфатно-солевой буфер. Через 10 мин образцы анализируют на проточном цитофлюориметре FACS Calibur («Becton Dickinson») в программе Cell Quest. Оценивают процент двойных позитивных бактерий (ФИТЦ⁺, ПИ⁺) среди ФИТЦ⁺Candida albicans на гистограмме.

Метод лазерной проточной цитометрии основан на двойном окрашивании флюорохромами бактерий, что позволяет визуально отделить убитые микроорганизмы от живых и оценить их количество. На рис. 1

Полученные нами данные при исследовании пациентов контрольной группы (n=7) позволили определить показатель нормы бактерицидности ротовой жидкости — 29,84±14,90%.

При исследовании бактерицидной активности ротовой жидкости у больных с дисбактериозом СОР (n=30) основной группы мы отметили статистически достоверно большее количество убитых микроорганизмов, чем у доноров (рис. 2).

Бактерицидность ротовой жидкости у пациентов основной группы составила: в 1-й подгруппе — 35,0±4,0%, во 2-й — 40,16±2,31%, в 3-й — 50,83±6,01%, в 4-й — 64,83±5,98%. Таким образом, повышение уровня бактерицидности ротовой жидкости прямо пропорционально степени тяжести дисбактериоза СОР (рис. 3).

Увеличение числа лизированных бактерий, по всей видимости, связано с высвобождением содержимого гранул нейтрофилов, привлеченных в очаг воспаления и активированных микробами СОР. Антимикробные пептиды и протеины нейтрофилов и других клеток обеспечивают не только внеклеточный механизм киллинга, но и влияют на функционирование других клеток. Важно отметить, что при высоких концентрациях (≥50 мкг/мл) дефензины (HNP) 1—3 и кателицидин (hCAP-18/LL37) проявляют цитотоксическое действие по отношению к клеткам собственного организма. Кроме того, в этих концентрациях они индуцируют высвобождение интерлейкина-8 и нейтрофилактивирующего белка-78 из эпителиальных клеток, что привлекает в очаг дополнительные нейтрофилы. Из привлеченных в очаг воспаления нейтрофилов высвобождаются продукты окислительного взрыва нейтрофилов, а системы каталазы и супероксиддисмутазы не способны минимизировать их повреждающее действие на собственные ткани организма. Из активированных нейтрофилов высвобождаются и эластаза, коллагеназа, желатиназа и др., которые также вносят свой вклад в повреждение тканей. Таким образом, повышение бактерицидной активности ротовой жидкости у пациентов с III и IV степенями тяжести дисбактериоза приводит к подавлению процессов репарации, появлению патологических элементов СОР.

Так как микрофлора СОР представляет собой высокочувствительную индикаторную систему, реагирующую качественными и количественными сдвигами при изменении состояния местного (мукозального) иммунитета [1, 4], метод определения бактерицидной активности ротовой жидкости, являясь высокоспецифичным, высокочувствительным и быстрым в диагностике дисбактериоза СОР, дает возможность включить в комплексную терапию препараты, способные как нивелировать активность грибковой и сопутствующей патогенной бактериальной микрофлоры, так и нормализовать показатели мукозального иммунитета.

Данные о состоянии мукозального иммунитета, полученные нами с применением метода определения бактерицидности ротовой жидкости, убедительно доказывают возможность применения данного метода в комплексной диагностике дисбактериоза СОР.