Клинический опыт применения неинвазивной пренатальной диагностики резус-фактора плода

В последние годы интенсивно разрабатываются неинвазивные методы дородовой диагностики различной наследственной патологии. Риск развития акушерских осложнений при их проведении существенно ниже, чем при использовании инвазивных методов. Наиболее часто неинвазивные методы, не требующие забора плодного материала, применяют для диагностики у плода врожденных пороков развития и хромосомных синдромов. Сфера неинвазивной пренатальной диагностики не ограничивается диагностикой генетических особенностей и анеуплоидий плода. Одно из активно развивающихся направлений — неинвазивное генетическое определение резус-фактора плода у резус-отрицательной беременной женщины [1—4].

До настоящего времени преемственность результатов исследований — речь идет о неинвазивной пренатальной диагностике (НИПД) — от научных изысканий до клинической практики была довольно фрагментирована. Успехи в улучшении аналитических характеристик тест-систем, стандартизация протоколов выделения внеклеточной фетальной ДНК (вкфДНК) и последующей амплификации с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР) повысили диагностическую точность, чувствительность и специфичность методик и активно способствуют внедрению последних в повседневную клинико-лабораторную практику [5].

Цель исследования — определение аналитических возможностей методики неинвазивного определения резус-фактора плода по исследованию крови беременной женщины с использованием тест-систем Тест-RHD плюс, АмплиПрайм ДНК-сорб-Б, Rotor-Gene6000.

В исследование включены результаты обследования 46 беременных резус-отрицательных женщин, наблюдавшихся и родоразрешенных в БУЗОО «Городской клинический перинатальный центр». Критериями включения явились резус-отрицательная принадлежность крови беременной; беременность, подтвержденная объективными методами; срок гестации более 10 нед, наличие информированного добровольного согласия беременной.

Для экстракции внеклеточной циркулирующей фетальной ДНК из клинического материала (крови беременной) применяли комплект реагентов АмплиПрайм ДНК-сорб-Б. В результате выделения получался высокоочищенный препарат ДНК, свободный от ингибиторов реакции амплификации, обеспечивающий высокую аналитическую чувствительность ПЦР-исследования. Для определения резус-фактора плода методом ПЦР с гибридизационно-флюоресцентной детекцией использовался набор реагентов Тест-RHD плюс, амплификатор Rotor-Gene6000.

Для получения плазмы кровь (не менее 8 мл) отбиралась в пробирку с EDTA-антикоагулянтом, последующее отделение плазмы проводилось в течение 3 ч с момента взятия крови. Программа амплификации представлена в табл. 1.

Все реакции сопровождались постановкой отрицательного и положительного контроля (набор Тест-RHD). Результаты ПЦР-исследования считались достоверными при получении правильных результатов для отрицательных и положительных контролей амплификации.

Полученные результаты подтверждались серологическим методом исследования крови новорожденного после родоразрешения обследуемой.

Проанализированы характеристики методики: диагностическая точность, чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного результата теста, прогностическая ценность отрицательного результата теста.

По результатам ДНК-анализа 46 образцов крови положительный резус-фактор был выявлен в 33 (71,7%) образцах, в 13 (28,3%) — резус-фактор плода по данным анализа был отрицательным. Данные результаты были подтверждены серологическим методом исследования резус-фактора у новорожденных. В одном случае отмечено несовпадение результата анализа: при положительном результате по данным тест-системы новорожденный оказался резус-отрицательным, при этом не представлялось возможным уточнить генетический статус плода, проанализировав буккальный соскоб, ввиду отказа пациентки от исследования.

Исследованы аналитические характеристики методики: диагностическая точность составила 97,82%, чувствительность — 100%, специфичность — 92,85%, прогностическая ценность положительного результата — 96,96%, прогностическая ценность отрицательного результата —100% (табл. 2).

Следует особо отметить, что при анализе возможных причин расхождения полученных результатов в указанном случае были установлены нарушения правил транспортировки и хранения материала. Таким образом, данный результат не может учитываться при оценке аналитических возможностей данного метода диагностики и свидетельствует о дефекте диагностического цикла на долабораторном этапе. Увеличение объема исследования поможет более достоверно определить диагностические параметры методики.

В РФ активно внедряется уже прижившаяся в европейских странах методика Rh (D)-генотипирования плода [6—9]. Чувствительность данного метода при сроке беременности 10—11 нед, по данным F.Clausen [10], составляет 99,3%, по другим сообщениям [11] — 98,7%, специфичность — 100%. Разработаны ДНК-зонды и к другим антигенам эритроцитов: С, Е, К, FYA, JKA, JKB, M, S(Соединенное королевство Великобритания) [12].

Учеными отмечена экономическая эффективность включения RHD-генотипирования плода в программу наблюдения и ведения беременных[13]. В Дании определение резус-принадлежности плода по исследованию крови матери входит в стандарты наблюдения и ведения беременных. Данный дородовый скрининг позволяет отобрать беременных, нуждающихся в проведении плановой профилактики резус-иммунизации, в 28—30 нед [14]. Референсная лаборатория в Бристоле выполняет данные исследования с 2001 г., и в настоящее время проводит около 200 исследований женщин в год в сроки 26—32 нед беременности. Расходящиеся результаты исследования отсутствуют с 2005 г.

В мировой клинической практике разработаны несколько экономических моделей, позволяющих судить об экономической целесообразности применения методов для предотвращения резус-иммунизации. С учетом стоимости проведения исследования был сделан вывод о том, что плановая иммунопрофилактика остается предпочтительным методом профилактики резус-иммунизации [15]. Данная позиция разделяется Итальянским обществом акушеров-гинекологов (SIGO) [16]. Кроме того, обсуждается возможность внедрения в повседневную практику методов RHC/c-, RHE/e-, KEL-генотипирования плода [6]. В Норвегии действует программа скрининга, включающая не только типирование резус-принадлежности плода по исследованию крови матери, но и определение тромбоцитарных аллелей HPA-1A с целью идентификации HPA-1b1b и последующего проведения профилактических мероприятий[17].

В Швеции в 2012 г. при внедрении методики в клиническую практику получены следующие результаты: инвазивное определение резус-фактора плода выполнено у 4118 беременных женщин, медиана срока беременности составила 10 нед. Повторный анализ пришлось выполнить в 211 (5,1%) случаях. Выявлен положительный резус-фактор плода в 2401 (58,3%) случае, отрицательный — в 1552 (37,7%), результаты были неубедительными в 165 (4%) наблюдениях после первого тестирования. После повтора анализа 147 образцов из 165 результаты только 14 остались неубедительными, что было связано с наличием слабого или неэкспрессирующегося материнского RHD-гена. В качестве «золотого стандарта» для подтверждения резус-фактора новорожденных применялось серологическое его определение. Количество ложноотрицательных результатов составило 55 (2,4%) из 2297, ложноположительных — 15 (1,1%) из 1355. Чувствительность и специфичность методики оказались близкими к 99% в образцах после 8-й недели беременности. С 22-й недели беременности чувствительность составила 100% [18].

В России многоцентровое исследование неинвазивного определения резус-фактора выполнялось на базе 11 учреждений (анализ показателей информативности наборов реагентов Тест-SRY и Тест-RHD при определении пола и резус-фактора плода). Представлены результаты обширных доклинических испытаний наборов реагентов Тест-SRY и Тест-RHD производства компании «ТестГен» для раннего неинвазивного определения пола и резус-фактора плода по исследованию крови беременной. Проведен анализ данных, полученных в ходе многоцентрового исследования на базе 11 лабораторий. В исследовании приняли участие 1817 беременных, 1006 были тестированы для определения пола плода и 811 — для определения резус-фактора плода (все женщины, у которых проводилось тестирование для определения резус-фактора плода, сами имели отрицательный резус-фактор). Установлено, что методики определения пола и резус-фактора плода по исследованию крови беременной с применением наборов Тест-SRY и Тест-RHD имеют высокие показатели диагностической точности, чувствительности и специфичности [19].

1. Методика определения резус-фактора плода по исследованию крови беременной в ранние сроки беременности с использованием одноэкзонного метода отличается высокой диагностической точностью, чувствительностью и специфичностью; является простой и надежной в исполнении и может быть рекомендована для применения в повседневной клинической практике.

2. Для правильного определения резус-фактора плода по исследованию крови беременной необходимо соблюдение следующих условий: проведение исследования, начиная с 10-й недели беременности; правильное обращение с плазмой; выделение ДНК в максимально быстрые сроки; выделение ДНК с использованием надежной технологии; организация работы в ПЦР-лаборатории согласно действующим национальным нормам; четкое следование инструкции[20].