Нормогонадотропная ановуляция — форма овариальной недостаточности, характеризующаяся неизмененным базальным уровнем фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) в крови, может быть обусловлена экстрагонадными и овариальными факторами (В.В. Потин и соавт., 1990). Данная патология является частой причиной нарушения менструального цикла и бесплодия [1] и составляет, по данным ВОЗ [2], 85% от всех нарушений функции яичников. Нормогонадотропную недостаточность яичников принято считать результатом центральных регуляторных нарушений [3, 4]. К настоящему времени установлено, что приблизительно у 35% больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников механизм положительной обратной связи в гипоталамо-гипофизарно-овариальной системе интактен. Овариальная недостаточность у этих больных, следовательно, связана с первично-яичниковыми факторами. Если при гипергонадотропной аменорее примордиальные и полостные фолликулы, как правило, полностью отсутствуют или их число резко снижено, у женщин с нормогонадотропной недостаточностью яичников фолликулярный аппарат сохранен и способен поддерживать продукцию эстрадиола на уровне, превышающем пороговый для запуска механизма отрицательной обратной связи между яичниками и гипофизом. Овариальная недостаточность при этом может быть связана с несостоятельностью доминантного фолликула, уровнем секреции эстрадиола, недостаточным для реализации интактного механизма положительной обратной связи между яичниками и гипофизом [5, 6]. Недостаточная продукция эстрогенов доминантным фолликулом может быть обусловлена хроническим аднекситом или аутоиммунным оофоритом [5]. Другой возможной причиной первично-овариальных нарушений может быть дефект ферментов, ответственных за стероидогенез в яичниках. Можно предположить, что повреждения в гене ароматазы р450, отвечающей за конверсию андрогенов в эстрогены, могут играть определенную роль в патогенезе данной патологии.

Энзимный комплекс ароматазы катализирует превращение С19-андрогенных стероидов в эстрогены, реализует биосинтез эстрона из андростендиона и эстрадиола из тестостерона [7]. Ген ароматазы (CYP19) человека локализован на 15-й хромосоме в локусе 15q21.1, охватывает не менее 70 кбайт информации геномной ДНК. Генетические изменения в этом локусе могут изменить активность ароматазы и таким образом повлиять на продукцию стероидных гормонов яичниками [8, 9]. Ген ароматазы является полиморфным. Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими аллелями, что обусловливает разнообразие признаков внутри вида. В гене ароматазы CYP19 в интроне 4 существует тетрануклеотидный повтор (ТТТА)n. Количество повторов варьирует от 7 до 13 копий. Рядом с данным повтором выявлена делеция трех нуклеотидов (TCT). Тетрануклеотидный полиморфизм привлекает внимание с момента выявления увеличения распространенности аллеля (ТТТА)12 гена CYP19 у больных раком молочной железы [10, 11]. Одновременно было показано снижение уровня эстрогенов в крови женщин с меньшим числом повторов (ТТТА)n гена CYP19 [10]. При исследовании полиморфизма (ТТТА)n в популяции китайских женщин была выявлена наибольшая распространенность коротких аллелей у больных с синдромом поликистозных яичников (СПЯ) по сравнению с этим показателем в контрольной группе здоровых женщин. При этом в группе женщин с СПЯ с разными генотипами не было выявлено достоверных различий в уровне стероидных гормонов в крови [12, 13]. Имеются работы [14], в которых показано, что больные с СПЯ, гомозиготные по коротким аллелям, имеют более высокий коэффициент тестостерон/эстрадиол, более высокий уровень тестостерона в крови и более высокое отношение ЛГ/ФСГ по сравнению с таковыми у гомозиготных пациенток по длинным аллелям. Определена взаимосвязь полиморфизма гена СYР19 (ТТТА)n-повторы с минеральной плотностью костной ткани у женщин в пери- и постменопаузальном возрасте. Так, женщины с аллелем (TTTA)11 и/или (ТТТА)12 в генотипе имеют значительно большую минеральную плотность костной ткани и не страдают остеопорозом в отличие от женщин, в генотипе которых имеется меньшее количество повторов (ТТТА) [15]. Результаты этого исследования косвенно свидетельствуют о более высоком уровне эстрогенов в крови женщин, несущих аллель (ТТТА)11 и/или (ТТТА)12. Эстрогены играют существенную роль в развитии синдрома преждевременного полового созревания. При исследовании количества повторов (ТТТА) в группе девочек с данной патологией было выявлено, что аллель (ТТТА)13 встречается только в основной группе и отсутствует у здоровых девочек контрольной группы. Носители аллеля (ТТТА)13 имели значительно более высокий уровень эстрогенов в крови. Эти результаты также могут свидетельствовать об ассоциации ароматазной активности с числом повторов (ТТТА) [16].

Аллель (ТТТА) 7-го гена CYP19 встречается в двух вариантах: стандартном – с наличием тринуклеотида ТСТ на 5’-конце (insertion — Ins) и в «укороченном» — без TCT (deletion — Del) [17]. Более низкое количество повторов (ТТТА)n гена CYP19, в частности del-(ТТТА)7, ассоциируется с увеличением уровня андрогенов и уменьшением содержания эстрогенов в крови и, возможно, снижением ферментативной активности ароматазы [18]. В программах экстракорпорального оплодотворения было отмечено, что с увеличением числа повторов (ТТТА)n гена CYP19 и с генотипом Ins/Ins или Ins/Del созревание фолликулов происходит при использовании более низких доз ФСГ [19].

В 2012 г. В.А. Савиной и соавт. [20] не было выявлено ассоциации аллельных вариантов гена ароматазы CYP19 — полиморфизм (ТТТА)n и del (TCT) с развитием СПЯ. Однако в данной работе в группе обследованных женщин с СПЯ учитывалась только общая ароматазная активность яичников, тогда как ароматазная активность отдельных фолликулов не определялась.

Цель исследования — изучение новых звеньев патогенеза нарушения функции яичников при нормогонадотропной ановуляции и ее клинических проявлений у больных.

Активность ароматазы антральных фолликулов с помощью пробы с ингибитором ароматазы летрозолом (патент № 2481587) определена у 190 женщин репродуктивного возраста. У 175 женщин диагностирована нормогонадотропная ановуляция: у 81 больной с ановуляторным циклом имелись клинические, гормональные и эхографические признаки СПЯ, у 43 пациенток с помощью лапароскопии был выявлен наружный генитальный эндометриоз (НГЭ), у 51 женщины причины ановуляции не были верифицированы.

Контрольную группу составили 15 здоровых женщин в возрасте от 23 лет до 31 года с полноценным овуляторным менструальным циклом. Средний возраст составил 26,9±0,7 года. Индекс массы тела (ИМТ) варьировал от 17,6 до 24,1 кг/м² и в среднем составил 21,4±0,5 кг/м². Ни у одной женщины контрольной группы не было отмечено гирсутизма и угревой болезни.

Женщинам обеих групп было проведено стандартное обследование, включающее сбор анамнеза, осмотр, определение гирсутного числа по шкале Ферримана—Галвея, распространенность угревой сыпи по классификации угревой болезни Американской академии дерматологии [21], гинекологический осмотр. Ультразвуковое исследование органов малого таза проводили на аппарате SonoAce X4 с использованием вагинального датчика с частотой 5,0 МГц. Оценивали объем яичников, количество, размеры и расположение антральных фолликулов.

Гормональные исследования проводили иммуноферментным методом на 2-й день менструального цикла. Содержание в сыворотке крови лютеинизирующего гормона (ЛГ), ФСГ, пролактина андростендиона, свободного тестостерона, эстрадиола и эстрона, антимюллерова гормона (АМГ) определяли с помощью специальных наборов.

Пробу с ингибитором ароматазы р450 летрозолом проводили на 2-й день менструального цикла. До приема 10 мг летрозола и через 48 ч после него в сыворотке крови определяли содержание эстрадиола (Э2). Ароматазную активность фолликулов определяли с помощью коэффициента, равного отношению разности уровней эстрадиола (пмоль/л) в сыворотке крови до приема летрозола и через 48 ч после него (∆Э2) к содержанию в крови АМГ (нг/мл): ∆Э2/АМГ.

Генетическое исследование проводили на образцах ДНК, полученных стандартным способом из ядер лимфоцитов периферической крови в соответствии с методикой, приведенной в руководстве J. Sambruuk и соавт. (1989) с модификациями. При идентификации полиморфного микросателлита (ТТТА)n и делеции трех нуклеотидов (TCT) в интроне 4-го гена CYP19 использовали следующие условия полимеразной цепной реакции (ПЦР): после денатурации (94 °C, 7 мин) проводили 30 циклов амплификации в режиме: 94 °C — 40 с ; 55 °C — 40 с; 72 °C —1 мин. Смесь для амплификации объемом 25 мкл включала 15 нмоль каждого праймера, 67 ммоль трис-HCl, 16,6 ммоль сульфата аммония, 6,7 ммоль MgCl2, 6,7 мкмоль ЭДТА, 10 ммоль меркаптоэтанола, 170 мкг BSA, 1,0 ммоль каждого dNTP и 2U ДНК-полимеразы. Анализировали продукты реакции в 7,5% полиакриламидном геле. Гель окрашивали водным раствором бромистого этидия (0,5 мкг/мл), просматривали в ультрафиолетовом свете на трансиллюминаторе Macrovue и фотографировали в системе видео-гель-документации. Количество ТТТА-повторов в гене CYP19 определяли на электрофореграммах по наличию продуктов амплификации определенного размера. Размеры ПЦР-продукта, соответствующие определенным повторам, были следующими: (ТСТ)del (TTTA) — 166 пар оснований ДНК (п.о.), (ТТТА)7 — 169 п.о., (ТТТА)8 — 173 п.о., (ТТТА)9 — 177 п.о., (ТТТА)10 — 181 п.о., (ТТТА)11 — 185 п.о., (ТТТА)12 — 189 п.о., (ТТТА)13 — 193 п.о.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с применением стандартных пакетов программ прикладного статистического анализа (Statistica for Windows v. 10.0, Microsoft Excel) с использованием методов параметрической и непараметрической статистики. Для оценки межгрупповых различий значений, имеющих непрерывное распределение, применяли t-критерий Стьюдента и ранговый U-критерий Манна—Уитни. Анализ зависимости между признаками проводили с помощью rs-критерия Спирмена. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы принимали равным 0,05.

У здоровых женщин прием летрозола вызывал закономерное снижение уровня эстрадиола в крови в среднем с 144,9±7,9 до 102,3±4,2 пмоль/л (р<0,05). Это снижение уровня эстрадиола (разность показателей — ∆Э2) характеризовало активность ароматазы яичников, так как у больных с эндометриозом на фоне применения аналога гонадотропин-рилизинг-гормона реакция эстрадиола на летрозол практически отсутствовала [22]. Поскольку уровень АМГ в крови соответствует числу антральных фолликулов [23], коэффициент ∆Э2/АМГ отражает ароматазную активность отдельных фолликулов яичников. У обследованных нами здоровых женщин границы доверительного интервала коэффициента ∆Э2/АМГ при р=0,05 колебались от 8,4 до 27,2.

Из 175 больных с нормогонадотропной ановуляцией у 40 (22,8%) имелась низкая ароматазная активность фолликулов (коэффициент ∆Э2/АМГ<8,4). Возраст в данной выделенной группе женщин колебался от 18 до 33 лет, составив в среднем 25,7±0,7 года. Индекс массы тела варьировал от 14,9 до 42,7 кг/м² и в среднем составил 23,8±0,9 кг/м². Избыток массы тела выявлен у 2 больных, ожирение I степени — у 5, III степени — у 1, дефицит массы тела был определен у 3 больных. Возраст менархе колебался от 11 до 17 лет и в среднем составил 13,1±0,2 года. Позднее менархе (в возрасте старше 15 лет) отмечено у 4 женщин. У большинства женщин было отмечено нарушение менструального цикла: опсоменорея — у 28. У 12 больных был сохранен регулярный менструальный цикл. У 5 женщин с диагнозом наружный генитальный эндометриоз имелись перименструальные кровянистые выделения и альгоменорея. Первичное бесплодие диагностировано у 16 больных, вторичное — у 2, у 1 больной спонтанно наступившая беременность закончилась срочными родами, у 1 женщины имелось невынашивание беременности в анамнезе. Гирсутное число у женщин с нормогонадотропной ановуляцией и низкой ароматазной активностью фолликулов в среднем составило 8,6±0,5 и колебалось от 4,0 до 15,0. Гирсутизм (гирсутное число >12) был выявлен у 8 (20%) женщин. У 25 больных имелась угревая сыпь, у 14 из них была диагностирована первая степень, у 11 — вторая степень распространенности угревой сыпи.

Общее количество фолликулов в яичниках в группе больных с низкой ароматазной активностью (21,0±0,7) достоверно (р=0,01) превышало количество фолликулов в яичниках здоровых женщин (12,6±0,7). Объем яичников в группе женщин с низкой ароматазной активностью был также достоверно больше, чем у женщин в контрольной группе (28,8±1,7 и 16,9±1,6 см³ соответственно; р=0,001).

Результаты гормонального обследования больных с дефицитом ароматазы представлены в табл. 1.

Содержание эстрадиола в крови больных с дефицитом ароматазы на 2-й день менструального цикла (140,1±5,3 пмоль/л) существенно не отличалось от показателя в контрольной группе (144,9±7,9 пмоль/л). Возможно, низкая ароматазная активность фолликулов служит пусковым моментом для увеличения числа антральных фолликулов, направленного на поддержание уровня эстрадиола в крови, препятствующего «растормаживанию» гонадотропной функции гипофиза. Это подтверждается достоверной отрицательной корреляцией (r=–0,7) ароматазной активности с числом антральных фолликулов и положительной корреляцией (r=0,5) с уровнем эстрадиола в крови. Увеличение когорты антральных фолликулов сопровождается усилением продукции АМГ (р<0,005), который способен тормозить овариальную ароматазу [24] и тем самым в еще большей степени нарушать стероидогенез и фолликулогенез в яичниках.

Более высокое содержание эстрона в крови больных с дефицитом ароматазы (348,6±30,0 пмоль/л) по сравнению с показателем в контрольной группе (249,6±22,1 пмоль/л) можно связать с усиленной конверсией андростендиона в эстрон в жировой ткани.

Средний уровень андрогенов (тестостерон, свободный тестостерон, андростендион) при дефиците овариальной ароматазы и в крови здоровых женщин существенно не различался. Превышение физиологического уровня свободного тестостерона имелось лишь у 11 (27,5%) и андростендиона лишь у 13 (32,5%) из 40 больных с дефицитом ароматазы (рис. 1, 2). Более значимым было повышение уровня 17-гидроксипрогестерона в крови больных (2,8±0,2 нмоль/л). У здоровых женщин этот показатель составил 1,7±0,1 нмоль/л.

Известно свойство ФСГ стимулировать овариальную ароматазу (S. Fitzpatrick, J. Richards, 1991). При дефиците ароматазы уровень ФСГ в крови (5,1±0,2 МЕ/л) был несколько ниже, чем у здоровых женщин (5,9±0,3 МЕ/л), но отличие не было статистически значимым (р=0,06). В то же время средний уровень ЛГ (5,9±0,7 МЕ/л) был достоверно (р=0,03) выше показателя у здоровых женщин (3,3±0,5 МЕ/л). В соответствии с этим отношение ЛГ/ФСГ при дефиците ароматазы (1,2±0,1) было выше (р<0,01) показателя у здоровых женщин (0,6±0,1).

В табл. 2 представлено распределение частот генотипов гена CYP19 —полиморфизма (ТТТА)n  — у больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой ароматазной активностью фолликулов и пациенток контрольной группы.

Самым частым генотипом по гену CYP19 — полиморфизму (TTTA)n у больных с низкой ароматазной активностью фолликулов явился (TTTA)7(TTTA)11 — у 37,5% пациенток, он не встречался у здоровых женщин. Данное различие между сравниваемыми группами было статистически значимым (р<0,02). Ранее в работе В.А. Савиной и соавт. [20], где проводился сравнительный анализ данного полиморфизма у больных с СПЯ и здоровых женщин, статистически значимого различия по распространенности данного генотипа обнаружено не было. Однако в этом исследовании ароматазная активность отдельных фолликулов при СПЯ не учитывалась.

У здоровых женщин самым частым генотипом оказался (ТТТА)7(ТТТА)8 — у 46,7% пациенток; в основной группе он встречался у 15% женщин, однако это различие не было статистически значимым. Остальные генотипы встречались реже в обеих группах, и при их анализе не было выявлено статистически значимых различий между сравниваемыми группами.

Анализ распределения частот генотипов гена CYP19 — del (TCT) у больных с нормогонадотропной ановуляцией и низкой ароматазной активностью фолликулов и у здоровых женщин представлен в табл. 3.

Сравнительный анализ частот генотипов и аллелей одного из двух полиморфных вариантов гена CYP19 — del (TCT) между выборками больных с нормогонадотропной недостаточностью яичников и низкой ароматазной активностью фолликулов и здоровых женщин не выявил достоверных различий.

Таким образом, дефицит ароматазы антральных фолликулов в начале менструального цикла (до инициации доминантного фолликула) выявляется у 22,8% больных с нормогонадотропной ановуляцией. Отрицательная связь ароматазной активности фолликулов с их числом и положительная связь с уровнем эстрадиола в крови позволяют считать, что увеличение когорты антральных фолликулов направлено на поддержание продукции эстрогенов яичниками в количестве, препятствующем «растормаживанию» гонадотропной функции гипофиза и развитию гипергонадотропной овариальной недостаточности. Гиперпродукция АМГ гранулезными клетками яичников и ЛГ гонадотрофами гипофиза усугубляет имеющийся дефицит овариальной ароматазы. Найденные особенности полиморфизма гена CYP19 позволяют предполагать генетическую обусловленность дефицита овариальной ароматазы.

Клинические (андрогензависимая дермопатия), эхографические (увеличение объема яичников и количества в них антральных фолликулов) и гормональные (гиперпродукция ЛГ гипофизом, АМГ и андрогенов яичниками) признаки СПЯ имеются в различных сочетаниях у 22 (55%) из 40 больных с дефицитом овариальной ароматазы. Это указывает на то, что дефицит овариальной ароматазы является существенным звеном патогенеза одной из форм СПЯ. Однако ни один из признаков СПЯ не патогномоничен для частичного дефицита овариальной ароматазы, и проведение пробы с летрозолом является единственным способом ее диагностики. Открытым остается вопрос об эффективности различных способов индукции овуляции у женщин с дефицитом овариальной ароматазы.

1. Частичный дефицит ароматазы антральных фолликулов выявляется у 22,8% больных с нормогонадотропной ановуляцией, служит существенным звеном патогенеза синдрома поликистозных яичников и в 55% проявляется клиническими, эхографическими и/или гормональными признаками этого синдрома.

2. Особенности полиморфизма гена CYP19 — полиморфизма (TTTA)n позволяют предполагать генетическую обусловленность дефицита овариальной ароматазы.

3. Проба с ингибитором ароматазы летрозолом позволяет количественно оценивать как суммарную овариальную ароматазную активность, так и ароматазную активность отдельных фолликулов.