Среди вирусных инфекций, передающихся половым путем, наибольшего внимания заслуживает возрастающая заболеваемость папилломавирусной инфекцией (ПВИ), распространенность которой среди сексуально активного населения планеты составляет 20-60% [4]. Вирус папилломы человека (ВПЧ) является доказанным экзогенным этиопатогенетическим фактором в развитии цервикальной интраэпителиальной неоплазии (ЦИН), в 15-20% инициирует развитие рака шейки матки (РШМ) [2, 3], в связи с чем многие авторы рассматривают ВПЧ-ассоциированный цервицит как ранний показатель предракового состояния [1]. Число случаев прогрессирования ЦИН в более высокую степень или инвазивный рак колеблется в очень широких пределах - от 1,4 до 60% (L. Harlan и соавт., 1991).

Онкогенная стратегия ВПЧ определяется интегративной вирогенией, т.е. включением вирусного генома в состав клеточных хромосом [5]. Тем не менее некоторые исследователи утверждают [10], что ДНК ВПЧ является убиквитарной, т.е. распространенной повсеместно, и вероятность ее обнаружения в женских половых органах достаточно высока.

В настоящее время не существует ни одного метода прогнозирования течения ЦИН у конкретной больной, определяющего возможность стойкой персистенции или прогрессирования ее в более высокую степень или инвазивный РШМ с указанием точной длительности этого процесса [7].

В нашей стране нет единого подхода к диагностике и лечению ВПЧ-ассоциированных заболеваний - воспалений и преинвазивных неоплазий шейки матки у молодых женщин. Так, существующие стандарты оправдывают агрессивный радикализм, который зачастую ведет к нарушению репродуктивной функции, а тактика, основанная на индивидуализации решения вопроса о биопсии и минимизации лечения, удлиняет динамическое наблюдение, что может повлечь за собой осложнения процесса.

Сотрудниками кафедры акушерства и гинекологии Нижегородской государственной медицинской академии был проведен анализ результатов 956 гистологических исследований фрагментов шейки матки, полученных после эксцизий, произведенных пациенткам с цервикальной патологией. Установлено, что 80,29% эксцизий, выполненных в ЦРБ, и 18,53% эксцизий, выполненных в ОКБ им. Н.А. Семашко, не имели данных о патологии ЦИН II+, т.е. оказались неоправданными. На наш взгляд, такая диагностическая агрессия являлась следствием недостаточности скринингового контроля ввиду ограниченных возможностей традиционных методов обследования.

Основная задача при обследовании больных с вирусными поражениями шейки матки заключается в выявлении преинвазивных интраэпителиальных неоплазий, стоимость лечения которых значительно меньше, чем РШМ. Известно, что эффективность затрат - важная составляющая любой диагностической программы, а биопсия шейки матки является не только травматическим вмешательством, но и затратным методом диагностики. Поэтому продолжается поиск новых методов диагностики (оптических, молекулярных) для решения вопроса о необходимости гистологического исследования. Выше изложенное диктует необходимость поиска методов терапии цервикальной патологии, нацеленных на снижение распространенности хронических (персистентных) папилломатозных инфекций, которые служат предшественниками инвазивных раковых опухолей [5].

Решение этих задач также стало возможным вследствие применения в клинической онкогинекологии новейших методов визуализации биотканей: оптической когерентной томографии с кольпоскопией (ОКТ-кольпоскопия) в новой скоростной модификации и молекулярно-биологического метода - определения онкобелка Е7, который, как известно, является маркером интегративной вирогении в цервикальных пробах. Известно, что продуктивная репликация ВПЧ возможна лишь в клетках, находящихся в стадии необратимой дифференцировки, в противном случае инфекция принимает абортивный характер. Вирусный геном элиминируется или начинает персистировать, используя механизм интегративной вирогении, когда, оказавшись в клетке, вирусная ДНК транслоцируется в ядро, где и происходят основные события. Вопреки нумерации, репликация ДНК ВПЧ начинается с образования онкопротеинов Е6 и Е7, ответственных за трансформацию клеток, т.е. Е6 и Е7 следует считать вирусными онкогенами [6]. Онкобелок Е7 присутствует во всех клетках, инфицированных ВПЧ и начавших неопластическую трансформацию вплоть до развития РШМ, поэтому его определение очень важно для оценки риска развития РШМ у конкретной пациентки [9]. E6 и Е7 - единственные белки ВПЧ, экспрессия которых устойчиво сохраняется в тканях, пораженных РШМ [1].

Очевидно, что выявление онкобелка Е7 ВПЧ 16-го и 18-го типов в образцах цервикальных проб имеет большое значение для диагностики неопластических заболеваний шейки матки, а также способствует повышению достоверности при ранней диагностике РШМ, вызванного ВПЧ 16-го и/или 18-го типов.

Цель исследования - повышение эффективности диагностики патологических состояний шейки матки у женщин репродуктивного возраста с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки путем включения в комплекс диагностических процедур определения наличия онкобелка Е7 ВПЧ 16-го и 18-го типов в цервикальных пробах.

Обследованы 416 пациенток в возрасте от 17 до 46 лет с ВПЧ-ассоциированными заболеваниями шейки матки - цервицитами и интраэпителиальными неоплазиями.

Все пациентки, вошедшие в исследование, по результатам обследования на ВПЧ с типированием и определением вирусной нагрузки были разделены на три группы: ВПЧ высокого канцерогенного риска (ВКР) были выявлены у 221 больной (1-я группа), ВПЧ низкого канцерогенного риска (НКР) - у 134 (2-я группа), у 61 пациентки ДНК ВПЧ не была обнаружена (3-я группа).

Всем женщинам было проведено комплексное обследование, включающее следующие этапы диагностики: ОКТ-кольпоскопию; оценку микробиоценоза нижнего отдела гениталий с назначением при необходимости этиотропного лечения и восстановлением лактофлоры; ВПЧ-тестирование, типирование, определение вирусной нагрузки с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени; повторную ОКТ-кольпоскопию; жидкостную цитологию; иммуноцитохимическое определение онкомаркера p16ink4a; определение онкобелка Е7 ВПЧ 16 и 18-го типов; биопсию шейки матки, выскабливание слизистой оболочки цервикального канала по показаниям.

ОКТ-кольпоскопия предусматривает расширенную кольпоскопию с применением традиционных тестов и использованием терминологии в соответствии с Международной классификацией кольпоскопических терминов, предложенной Номенклатурным комитетом Международной Федерации по кольпоскопии и цервикальной патологии в Рио-де-Жанейро в 2011 г., и параллельное ОКТ-сканирование с помощью «скоростной» модификации прибора ОКТ-1300У (ИПФ РАН, ООО «Биотехмед», Н. Новгород). Для получения изображения зонд приставляли к кольпоскопически визуализируемой зоне обследования и фиксировали легким прижатием на 5-7 с. Сбор и отражение данных на мониторе компьютера осуществляли в режиме реального времени с использованием программы, входящей в комплект ОКТ-установки.

Оценка микробиоценоза нижнего отдела гениталий осуществлялась с помощью качественного ПЦР-анализа на абсолютные патогены и исследования микробиоценоза урогенитального тракта методом «Фемофлор».

При выявлении бактериального и грибкового инфицирования проводилось лечение с применением препарата Полижинакс.

Полижинакс выпускается «Лабораторией Иннотек Интернасиональ» (Франция) в виде влагалищных капсул, является комплексным препаратом, в состав которого входят 2 антибиотика бактерицидного действия - неомицин и полимиксин В, а также противогрибковый антибиотик нистатин и диметикон.

Неомицин (в 1 капсуле содержится 35 000 МЕ), являясь аминогликозидом широкого спектра действия, активен в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных кокков, грамположительных палочек, таких, как коринебактерии и Mycobacterium tuberculosis, грамотрицательных бактерий, в частности Еscherichia сoli, Enterobacter aerogenes, Haemophilus influenzae, Klebsiella pneumoniae, Proteus vulgaris.

Полимиксин В (в 1 капсуле содержится 35 000 МЕ) - полипептидный антибиотик, активен в основном в отношении таких грамотрицательных бактерий, как Pseudomonas aeruginosa, исключая Proteus и Neisseria, а также in vitro в отношении Ureaplasma urealyticum. Большинство анаэробных микробов устойчивы к этим двум антибиотикам.

Третий компонент - нистатин (в 1 капсуле содержится 100 000 МЕ) оказывает in vitro и in vivo фунгицидное и фунгистатическое действие на грибы рода Candida, а также на грибы родов Histoplasma, Coccidioides, Cryptococcus. Диметикон, входящий в состав препарата, способствует равномерному распределению основных веществ по всей поверхности влагалища, также оказывает противовоспалительное действие.

В клинической практике при вагините и цервиците очевидно разведение концентрации препаратов вагинальными выделениями, также наблюдается значительное снижение количества лактобацилл в вагинальном биотопе. Эффективность полижинакса подтверждена сохранением чувствительности грамотрицательных и грамположительных микроорганизмов, дрожжеподобных грибов в разведениях изотонического раствора натрия хлорида 1:10, 1:100, 1:1000. Установлено также, что лактобациллы, выделенные из влагалища женщин, в концентрированном растворе и во всех исследуемых разведениях препарата оказались резистентными [8].

Лабораторный контроль эффективности лечения проводился через 3-4 нед после его окончания.

Для цитологического исследования материал забирали из цервикального канала, переходной зоны и экзоцервикса с помощью одноразовой цервикальной щеточки cyto-brush, а при наличии III типа зоны трансформации - с помощью щеточки cervix-brush. Оценку результатов цитологического исследования производили согласно классификационной системе Папаниколау (ПАП) в соотношении с классификациями Бетесда и ЦИН.

Иммуноцитохимическое определение онкомаркеров р16ink4a и Е7 ВПЧ 16-го и 18-го типов, гистологическое исследование проводились по общепринятой методике.

Забор материала для морфологической оценки осуществлялся с помощью биопсийной петли для радиоволновой хирургии.

В качестве одного из методов лечения применялась фотодинамическая терапия (ФДТ), в основе которой лежит фотохимическая реакция введенного в организм фотосенсибилизатора, в нашем исследовании фотодитазина, и лазерного излучения определенной длины волны в аэробных условиях. В результате этой реакции выделяются активные формы кислорода, разрушающие пораженные клетки. ФДТ позволяет не только выполнить локальную деструкцию патологических очагов эпителия, где произошла клиническая манифестация ПВИ, но и воздействовать на резервуар ВПЧ в латентном состоянии или недиагностированной субклинической форме, который остается в окружающих тканях и может являться основой для дальнейшего развития онкопатологии.

После процедуры ФДТ всем пациенткам назначался полижинакс с целью профилактики воспалительных осложнений при отхождении некротизированных тканей, что сопровождается значительной транссудацией и соответственно разведением препарата.

Средний возраст обследованных пациенток составил 29 лет. 69% женщин находились в возрастной группе до 30 лет. Это подтверждает многочисленные данные международных и отечественных исследователей о том, что у женщин молодого возраста ВПЧ-ассоциированная патология встречается чаще, однако и в зрелом возрасте она является актуальной проблемой.

При первом визите всем пациенткам проводилась ОКТ-кольпоскопия. Согласно общим положениям по Международной кольпоскопической классификации, принятой в Рио-де-Жанейро, неадекватная картина отмечалась в 87% случаев из-за проявлений воспаления, контактных кровотечений, рубцовых деформаций, III типа зоны трансформации. При ОКТ-зондировании влагалищной порции шейки матки у 66% пациенток были получены изображения в соответствующей желто-коричневой палитре, где оттенки желтого соответствуют большей, а оттенки коричневого - меньшей оптической плотности. Данные изображения были отнесены к доброкачественным из-за наличия субэпителиальных включений, нормальной скорости угасания сигнала и четкой двуслойности изображения, где верхний слой имеет меньшую оптическую плотность, чем нижний. Кроме доброкачественности, изображения отражали интенсивность воспалительного процесса эктоцервикса: явное усиление, ветвистость сосудистого рисунка, отек стромы, оцениваемый с помощью сниженной скорости угасания оптического сигнала.

В остальных 13% случаев были получены сомнительные изображения, характеризующиеся двуслойностью с одинаковой оптической плотностью слоев, либо наличием оптически более плотного верхнего слоя, либо с локусами «злокачественного» (быстроугасаемого) сигнала.

У 75% пациенток наблюдалась сопутствующая патология шейки матки, из них у 70% женщин ПВИ протекала на фоне эктопии либо эктропиона, рубцовая деформация цервикса отмечалась в 13% случаев, эндометриоз шейки матки - в 8%, полипы цервикального канала - в 3,5%.

Генитальные кондиломы как клиническая форма течения ПВИ были выявлены у 8,5% пациенток, в 4,5% случаев были диагностированы кондиломы шейки матки, в 5% - вульвы и влагалища. Распространенность данной патологии при беременности составила 62,5%.

Лечение генитальных кондилом являлось обязательным этапом ведения пациенток с ВПЧ-ассоциированными цервицитами. С профилактической целью на 6 дней пациенткам перед лечебными манипуляциями назначался полижинакс, не только обладающий выраженными антибактериальным и фунгицидным свойствами, но и оказывающий противовоспалительный эффект. Выбор метода определялся в зависимости от вида образований, их размера, обширности поражения, необходимости гистологического исследования; осуществлялась криодеструкция либо эксцизия и деструкция с помощью аппарата радиоволновой хирургии Сургитрон.

На втором этапе диагностического исследования выявлялась этиология воспалительного процесса. По нашим данным, ПВИ чаще всего сочеталась с уреаплазмозом (в 35% случаев) и кандидозом (в 10% случаев), в 7,5% случаев у пациенток с ПВИ был обнаружен микоплазмоз, в 5% - гонорея и цитомегалия, в 2,5% - трихомониаз и хламидиоз. В 30% случаев ВПЧ-инфекция протекала на фоне дисбаланса за счет снижения количества лактобактерий, а в 32,5% случаев - на фоне анаэробного дисбиоза.

Все пациентки получали соответствующую этиотропную терапию с последующим восстановлением лактофлоры влагалища и контролем эффективности лечения через 3-4 нед после его окончания. В качестве местного лечения использовался полижинакс.

Нами были обследованы 90 ВПЧ-позитивных пациенток с нарушением влагалищного микробиоценоза. Клиническое и лабораторное обследование пациенток осуществлялось до начала терапии полижинаксом, через 12 дней лечения и 3-4 нед после окончания лечения.

Эффективность терапии препаратом оценивали по 3 критериям: 1) по общему состоянию и самочувствию пациенток; 2) по клиническим данным (по данным анамнеза и гинекологического осмотра); 3) по данным лабораторных бактериоскопических исследований. По результатам обследования и лечения выявлены общее улучшение состояния и купирование симптомов вагинита у 94% пациенток. Отмечено изменение клинической картины и субъективных ощущений: изменение характера белей, уменьшение раздражения, зуда, жжения. По данным гинекологического осмотра также установлено улучшение состояния слизистой оболочки влагалища - уменьшение отечности и гиперемии. У большинства пациенток отмечен положительный бактериологический эффект препарата: подавление патогенной микрофлоры, в том числе грибов рода Candida (по данным бактериоскопии).

На третьем диагностическом этапе проводилось ВПЧ-типирование. У 53,12% обследованных были выявлены ВПЧ высокого канцерогенного риска (16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 48, 51, 52, 56-й типы), 14,57% пациенток были инфицированы ВПЧ низкого канцерогенного риска (6, 11, 42, 43, 44-й типы). В 15,62% случаев встречалось сочетание ВПЧ ВКР и ВПЧ НКР, а у 16,69% пациенток ДНК ВПЧ не было обнаружено.

После проведенного восстановления микробиоценоза нижнего отдела гениталий и соответственно после купирования признаков воспаления для динамического контроля на четвертом диагностическом этапе проводилась повторная ОКТ-кольпоскопия. Слабовыраженные поражения эпителия шейки матки, т.е. тонкий ацетобелый эпителий с неровными нечеткими краями, нежная пунктация и нежная мозаика (I степень по классификации, принятой в Рио-де-Жанейро) были зарегистрированы в 84,5% случаев. Кольпоскопические поражения II степени встречались в 8% случаев, из них 4,7% пришлись на грубую мозаику и грубую пунктацию, а 3,3% случаев - на симптом «поражения в поражении». Кольпоскопических данных, подозрительных на инвазию, выявлено не было.

На четвертом диагностическом этапе ОКТ-кольпоскопия имела прицельный характер: щуп ставился на зону максимальных кольпоскопических изменений для оценки ее оптической плотности и поиска злокачественных ОКТ-локусов. Следующим этапом оптической диагностики являлось сопоставление кольпоскопических и ОКТ-границ, «поиск кольпоскопически замаскированных изменений» эпителия и субэпителиальных структур, которые могут быть расценены как резервуар инфекции.

Следующим важнейшим диагностическим шагом являлось контролируемое ОКТ-кольпоскопией прицельное цитологическое исследование, производимое методом жидкостной цитологии. По результатам нашего исследования, у 87% пациенток цитологический мазок был отнесен к LSIL (low-frade squamous intraepithelial lesions - плоскоклеточное интраэпителиальное поражение низкой степени выраженности) по классификации Бетесда, среди них у 59,7% больных были мазки типа ASCUS (atypical squamous cell of undetermined significance - атипические клетки плоского эпителия неопределенного значения), т.е. II класс мазка по ПАП, что соответствует признакам ПВИ по системе ЦИН, а 27,3% мазков были отнесены к III классу по ПАП или к ЦИН I. У 13% женщин была выявлена нормальная цитологическая картина.

Пятый диагностический этап - иммуноцитохимическое определение онкобелков p16ink4a и Е7 ВПЧ 16-го и 18-го типов. Повышенный уровень экспрессии маркера p16ink4a, характерный для дисплазии многослойного плоского эпителия, был отмечен у 14,28% обследованных женщин. У 87,5% p16ink4a-позитивных пациенток цитологически была выявлена ЦИН I, негативная реакция у оставшихся 12,5% пациенток может свидетельствовать как о ложнопозитивных данных жидкостной цитологии и ложнонегативных данных определения онкомаркера p16ink4a, так и о реактивном характере дисплазии.

Шестой диагностический этап - определение онкобелка Е7 в цервикальных пробах. Е7-положительные пациентки составляли, по нашим данным, 78,33% среди женщин, страдающих ВПЧ-ассоциированными цервицитами. У 30,77% пациенток с цитологически подтвержденной ЦИН I онкобелок Е7 16-го и 18-го типов ВПЧ был отрицательным. Это может свидетельствовать о том, что ВПЧ находился в клетке в эписомальной форме либо ЦИН I развилась на фоне других высокоонкогенных типов ВПЧ.

Гистологическое исследование должно являться заключительным седьмым диагностическим этапом, так как этот метод является инвазивным, травматичным и может нарушить репродуктивные планы пациентки. Показаниями к проведению биопсии у пациенток с ВПЧ-ассоциированными цервицитами, по нашему мнению, являются следующие: наличие злокачественных ОКТ-локусов в отсутствие данных за HSIL (high-grade squamous intraepithelial lesions - плоскоклеточное интраэпителиальное поражение высокой степени выраженности) по результатам жидкостной цитологии; LSIL без положительной динамики при проведении патогенетической терапии и динамическом наблюдении в течение 18-24 мес; планирование сеанса ФДТ; возраст пациентки старше 35 лет; невозможность дальнейшего наблюдения; при III типе зоны трансформации обязательным является выскабливание слизистой оболочки цервикального канала. Биопсия должна проводиться под контролем ОКТ-кольпоскопии и быть максимально щадящей, поэтому в нашем исследовании мы применяли методы радиоволновой хирургии, что позволяло контролировать размер иссекаемого участка, глубину биопсии, получать образцы с минимальными коагуляционными повреждениями.

При выборе тактики дальнейшего ведения пациентки были разделены на 3 группы, в зависимости от конкретной клинической ситуации и согласно совокупности полученных результатов на этапах диагностики.

У 40% пациенток, у которых имело место сочетание доброкачественного типа ОКТ, I степени кольпоскопических изменений, LSIL и р16ink4a-негативной реакции, была определена тактика активного динамического наблюдения после курса противовирусной и иммуномодулирующей терапии при Е7-отрицательной реакции или нескольких таких курсов - при Е7-положительной реакции, в том числе в группе женщин, планирующих беременность.

У 18% пациенток, у которых отмечалось наличие злокачественных локусов, определяемых с помощью ОКТ-кольпоскопии, I-II степени кольпоскопических изменений, LSIL, р16ink4a-негативной или позитивной реакции, были выполнены прицельное гистологическое исследование, ФДТ и затем проводилось динамическое наблюдение. Всем пациенткам через 10 дней после процедуры ФДТ с профилактической целью назначались капсулы полижинакса. Диметикон, входящий в состав препарата, является активным экципиентом с функцией распространения основных его элементов по всей поверхности влагалища. Он также оказывает успокаивающее, обволакивающее воздействие на воспаленную слизистую оболочку влагалища и улучшает процессы заживления многослойного плоского эпителия эктоцервикса после отхождения некротических масс.

В 42% случаев при персистирующей субклинической ПВИ (доброкачественный тип при ОКТ-кольпоскопии, I степень поражения по данным кольпоскопии, LSIL, р16ink4a-негативная реакция, Е7-положительная или E7-отрицательная реакция) более 18-24 мес тактика ведения была следующей: прицельная биопсия, ФДТ, затем динамическое наблюдение c включением в стандартный диагностический комплекс определения онкобелка Е7 ВПЧ 16-го и 18-го типов. Ни у одной пациентки 2-й и 3-й групп не было отмечено воспалительных осложнений после применения ФДТ.

При выявлении цервикальных изменений, соответствующих HSIL, Сancer in situ производилась конизация шейки матки с последующим выскабливанием слизистой оболочки цервикального канала.

Гистологическое исследование включало тщательную оценку краев резекции с последующим решением вопроса о необходимости дальнейшего лечения - ФДТ. Исследование края резекции считалось положительным при наличии гистологических признаков ВПЧ-инфицирования. Размер зоны воздействия также уточнялся при ОКТ-кольпоскопии, как и последующий контроль после лечения, а также жидкостное цитологическое исследование, иммуноцитохимическое определение p16ink4a, определение онкобелка Е7 ВПЧ 16-го и18-го типов.

Всем небеременным больным с ВПЧ-ассоциированным цервицитом проводились противовирусное и иммуномодулирующее лечение и вакцинация квадривалентной вакциной с целью профилактики повторного инфицирования.

По окончании данного исследования нами предложен следующий алгоритм диагностических мероприятий по выявлению цервикальной патологии, представленный на рисунке.

Таким образом, типирование папилломавирусов, определение титра высокоонкогенных ВПЧ, определение в цервикальных пробах онкобелка Е7 ВПЧ 16-го и 18-го типов - реальная основа для прогнозирования злокачественной эволюции ПВИ, контроля эффективности проведенного лечения и дифференцирования эндогенных рецидивов от реинфекции. В то же время, по нашему мнению, назначение данного обследования нецелесообразно больным с установленным диагнозом ЦИН II и/или рака in situ, в связи с известной тактикой лечения.

Наличие в цервикальных пробах онкобелка Е7 ВПЧ 16-го и 18-го типов после проведенной терапии может указывать на продолжающуюся персистенцию вируса в наиболее опасной с точки зрения рецидивирования ЦИН-интегративной форме и может являться показанием к активному наблюдению и/или принятию своевременного решения о дальнейшем лечении.

1. Подтверждена значимость определения онкобелка Е7 ВПЧ 16-го и18-го типов в комплексном обследовании больных с цервикальной патологией в репродуктивном возрасте.

2. У больных с латентными и субклиническими формами ВПЧ-инфекции (ЦИН I) определение онкобелка Е7 необходимо для уточнения фазы существования ВПЧ в клетке-хозяине, и соответственно прогнозирования реализации его онкогенного потенциала для индивидуализации тактики ведения пациентки.