Лабораторное исследование влияния комплекса цитрусовых биофлавоноидов на пародонтопатоген P. Intermedia

В клинической практике врачу-стоматологу ежедневно приходится сталкиваться с пациентами, имеющими заболевания пародонта [1]. Главный их этиологический фактор — микроорганизмы, в частности, P. Intermedia [2]. Золотой стандарт антисептиков — хлоргексидин — вызывает ряд нежелательных побочных эффектов: окрашивание зубов и реставраций, мукозиты, нарушение вкусового восприятия [3, 4].

Один из альтернативных вариантов — натуральные антисептики биофлавоноиды. Термин «флавоноиды» появился в 1949 г. в связи с тем, что некоторые растения служили источником красителей желтого цвета (лат. flavus − желтый). В тот же период выявилось их положительное влияние на кровеносные сосуды человека, заключающееся в их способности уменьшать проницаемость стенок капилляров, что способствует заживлению ран. В его состав входят биофлавоноиды: нарингин (23,4%), неогесперидин (12,5%), гесперидин(1,4%) и др. [5, 6]. К такой группе веществ относятся цитрусовые биофлавоноиды.

Биофлавоноиды в комбинации с хлоргексидином являются на сегодняшний день малоизученной темой. Исследования ряда авторов свидетельствуют о потенциальной эффективности натуральных биофлавоноидов в отношении пародонтопатогенной микрофлоры, тем не менее этот вопрос нуждается в дальнейшем изучении [7, 8].

По данным Федеральной государственной программы первичной профилактики стоматологических заболеваний среди населения России за 2011 г. в возрастной группе 35—44 лет, проводимой СТАР, распространенность заболеваний пародонта является высокой — более 80%.

Главная причина заболеваний пародонта — микроорганизмы. Пародонтопатогенная микрофлора полости рта включает Porphyromonas gingivalis, Candida albicans, Porphyromonas intermedia и другие микроорганизмы, которые микробиологи относят к «красному комплексу» [9].

Хлоргексидин является золотым стандартом среди антисептиков. Но с его применением связано развитие побочных эффектов, включая мукозит, изменение восприятие вкуса и окрашивание зубов и реставраций [4, 10]. Нежелательные эффекты хлоргексидина стали движущей силой для исследований альтернативных антисептиков в отношении пародонтопатогенов [7, 11]. В частности, возник интерес к растительным биофлавоноидам. Ряд флавоноидов обладает антибактериальным (противомикробным) действием. Примером такого вещества является комплекс на основе цитрусовых биофлавоноидов. Это вещество было запатентовано в 2010 г. В его состав входят биофлавоноиды: нарингин (23,4%), неогесперидин (12,5%), гесперидин (1,4%) и др. Он водорастворим, нелетучий, устойчивый на свету, безопасен для употребления внутрь. Не окрашивает зубы [12]. Данный комплекс обладает антисептическим и противовоспалительным действием, не вызывает резистентности в отличие от антибактериальных препаратов [13, 14].

Цель исследования — в лабораторных условиях оценить активность цитрусовых биофлавоноидов в отношении пародонтопатогена P. Intermedia.

Бактериологический метод исследования был реализован в методике по автоматическому программируемому культивированию бактериальных популяций с целью определения тенденции формирования кривой, сопоставимой с основными точками развития популяции в периодической и полупериодической системе культивирования.

В эксперименте были использованы клинические изоляты микробных культур из коллекции кафедры микробиологии, иммунологии, вирусологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова — P. Intermedia. Первичный посев исследуемого материала проводили на питательные среды производства Himedia Laboratories Pvt. Limited (Индия): основа колумбийского кровяного агара (М144) с 5% (об/об) дефибринированной крови и селективной добавкой для выделения неспоровых анаэробов.

Трактовка результатов осуществлялась по изменению показателя оптической плотности (показатель в единицах МакФарланда) при длине волны λ=850 нм.

Для каждого варианта эксперимента была приготовлена микробная взвесь объемом 5 мл. Исходное оптическое значение этой взвеси составило 0,5 mcf (1,5·10⁸ КОЕ).

Для культивирования микробных культур использовали центрифужные пробирки 50 мл с мембранным фильтром (Швейцария), в которые добавляли стерильный питательный бульон, микробную взвесь и один из отягощающих компонентов: либо хлоргексидин 0,05%, либо смесь хлоргексидина 0,05% и цитрусовые биофлавоноиды.

Для подтверждения жизнеспособности культуры, а также корреляции оптической плотности с количественной характеристикой культивируемой комбинации проводились высевы 1 мл взвеси на плотную питательную среду. Забор выполнялся в условиях ламинарного бокса в начале экспоненциальной фазы (период ускоренного развития клеток) и в окончании истинного экспоненциального прироста клеток с использованием автоматической пипетки и стерильных наконечников.

По результатам культивирования клинического изолята P. Intermedia в контрольной пробирке первоначальные фазы развития анаэробной популяции отмечались до 12-го часа культивирования (рисунок). С 6-го по 12-й час прослеживался период ускоренного развития клеток (P-1), в котором по постепенному нарастанию оптической плотности прослеживались первичные генеративные признаки популяции (6—8-й час — преобладание процесса роста клеток; 8—12-й час — преобладание процесса первичного деления). Второй период (P-2) экспоненциальной фазы отождествлялся с цикличным равномерным приростом биомассы, в результате которого к 22-му часу экспериментального культивирования было достигнуто максимальное пиковое значение OD. Начиная с 23-го часа эксперимента в данной пробирке отмечалось снижение скорости деления клеток, что способствовало переходу в период отрицательного ускорения (P-3). На 24-й час культивирования была достигнута максимальная концентрация биомассы (показатель p), что отражалось в стабилизации показателя оптической плотности — 5,54±0,3 mcf. Фаза одновременного равновесного нахождения вновь образующихся и отмирающих клеток (стационарная фаза) имела достаточно длительную продолжительность, без существенных признаков изменения концентрации биомассы. Фаза отмирания отмечалась постепенным увеличением нежизнеспособных клеток с приобретением тенденции к экспоненциальной гибели микробной популяции.

Динамика изменения оптической плотности P. intermedia в эксперименте.

При анализе исследуемых образцов с концентрацией 0,05% хлоргексидина биглюконата отмечалась незначительная пролонгация адаптивной фазы на 2 ч относительно предыдущего образца. Тенденция развития клеток в периоде ускоренного развития оставалась аналогичной контрольному образцу, однако продолжительность этого периода была сокращена, что позволило популяции перейти в экспоненциальный прирост одновременно с контрольным образцом. Экспоненциальная фаза по своему характеру развития более чем в два раза была менее интенсивна относительно контрольного образца.

В образце, где к антисептическому агенту были добавлены цитрусовые биофлавоноиды, отмечалась более существенная задержка адаптивного периода (до 10 ч), а также постепенный и длительный прирост клеток в периоде ускоренного развития (до 16-го часа). Скорость прироста бактериальных клеток в экспоненциальной фазе была ниже, чем в предыдущих двух других образцах, что способствовало длительному процессу наращивания биомассы и переходу культуры в стационарное равновесие в более отдаленные сроки.

Комбинация цитрусовых биофлавоноидов + хлоргексидин 0,05% эффективнее подавляет рост бактерий, чем хлоргексидин 0,5%, продлевая адаптивную фазу (лаг-фазу) роста бактерии P. Intermedia.

Аналогичные результаты были получены для комбинации цитрусовых биофлавоноидов + хлоргексидин 0,2%. Таким образом, ополаскиватель на основе такой комбинации может рассматриваться в качестве альтернативного антисептика для лечения заболеваний пародонта.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Conflict of interest. No conflict of interests to declare.