Введение

Золедроновая кислота (ЗК) — аминобисфосфонат, который уменьшает костные осложнения при лечении онкологических заболеваний. Бисфосфонаты блокируют farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS) — фермент, находящийся внутри остеокласта, в результате остеокласт становится нефункционирующим. Таким образом, ЗК используется при химиотерапии для предотвращения метастазирования злокачественных новообразований [1]. В связи с высокой афинностью ЗК к рецепторам остеокластов ее также применяют при лечении остеопороза [2]. Однако нередко введение бисфосфонатов может осложниться развитием остеонекроза верхней или нижней челюсти. Гипотезы возникновения бисфосфонат-индуцированного остеонекроза челюстей следующие: угнетение ангиогенеза, дисфункция иммунитета, токсическое действие на мягкие ткани, периапикальные изменения и изменения в периодонте у взрослых [3]. Так как сосудистый компонент является одним из возможных механизмов развития повреждения при бисфосфонатном остеонекрозе челюсти [4, 5], воздействие на устранение сосудистого повреждения может быть перспективным для профилактики этой патологии. Одним из подобных направлений может быть влияние на состояние эндотелия, в частности на эндотелиальный гликокаликс.

Сулодексид — препарат, состоящий из смеси высокоочищенных гликозаминогликанов: 80% гепарина (electrophoretically fast-moving) и 20% дерматан сульфата, который применяется для лечения микро- и макроангиопатий. Обладает фибринолитическим, ангиопротективным, гиполипидемическим, антикоагулянтным, антиадгезивным, антитромботическим действиями. В исследовании Changwei Liu (2017) показано, что cулодексид индуцирует реконструкцию гликокаликса после повреждения интимы, облегчая функциональное и структурное восстановление эндотелия путем восстановления гликокаликса, в том числе способствуя уменьшению воспалительной инфильтрации лейкоцитами стенки сосуда [1, 6].

Цель исследования — определить возможность уменьшения бисфосфонат-индуцированного остеонекроза за счет влияния на эндотелий сосудов.

Материал и методы

В исследование взяты 27 крыс-самцов линии Вистар (ФГУП «Питомник лабораторных животных «Рапполово») 6-месячного возраста со средними показателями массы тела 380—440 г. Животных содержали на неограниченном потреблении стандартного корма К-120 («Информ-корм», Россия) и воды при фиксированном световом режиме 12.00:12.00 (свет: темнота). Температуру поддерживали в пределах 22—25 °С, относительную влажность — 50—70%. Длительность карантина для всех животных составляла 14 дней.

Все животные были разделены на три основные группы (рис. 1):

ЗК — 9 крыс. Животным 1 раз в неделю в течение 6 нед внутривенно вводили золедроновую кислоту.

ЗК + СД — 9 крыс. В течение 6 нед также внутривенно вводили золедроновую кислоту и 3 нед — препарат Вессел Дуэ Ф.

Контроль — 9 крыс. Животным 1 раз в неделю в течение 6 нед внутривенно вводили 0,9% стерильный раствор хлорида натрия.

На 3-й день после последнего введения ЗК (1-я и 2-я группы) или физиологического раствора (3-я группа) животным под анестезией — Золетил 100 (Zoletil 100; «VIRBAC», Франция) 1 мл, Ксила (Xyla, Xylazine 2%; Interchemie werken «De Adelaar B.V.», Нидерланды) 1 мл, вода для инъекций 1 мл — удаляли 1 премоляр нижней челюсти слева с помощью щипцов для удаления зубов (HULL Tooth Forceps DI030R#101; «Aesculap, Inc., Central Valley, PA», США).

Оценку кровотока в ткани пародонта определяли через 3 дня после удаления зуба методами ультразвуковой высокочастотной допплерографии (УЗДГ) и лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) 1 раз в неделю в течение 7 нед.

Дефекты кости нижней челюсти визуализировали с помощью трехмерной компьютерной томографии на 3-й день после финального исследования микроциркуляции (на 66-й день от начала эксперимента, на 28-й день после удаления) и морфологически. Для лучевой диагностики был использован конусно-лучевой компьютерный томограф Galileos («Sirona», Германия) с программным обеспечением Galaxis, лучевая нагрузка 50 мЗв, напряжение на трубке 80 кВ, сила тока 4 мА время сканирования 14 с, толщина скана 0,15 мм.

Нижнюю челюсть крысы декальцинировали в фиксаторе-декальцинаторе формалин/этилендиаминтетрауксусной кислоте в течение 14 дней. Затем фрагменты челюстей направляли на патоморфологическое исследование. Использовали стандартную методику приготовления тонких срезов из парафиновых блоков и изготовление гистологических препаратов с окраской гематоксилином и эозином, которые изучали с помощью световой микроскопии при двадцатикратном увеличении (DP-2 BSW; «Olympus», Tokyo, Japan).

УЗДГ проводили с помощью прибора Минимакс-Доплер-К (Санкт-Петербург, Россия), с использованием двухэлементного высокочастотного ультразвукового датчика с частотой 25 МГц, диаметром рабочей части 1,5 мм. Определяли тканевую перфузию слизистой оболочки и глубжележащих тканей на глубине до 3,5 мм и регистрировали интегральную величину кровотока.

ЛДФ проводили с использованием лазерного флоуметра BLF21 («Transonic», США) с иглообразным датчиком (1,2 mm (ABLPHN18 тип N)).

Для оценки реактивности сосудов микроциркуляторного русла пародонта осуществляли функциональную пробу с 3% ацетилхолином, который наносили на слизистую оболочку с помощью кружка фильтровальной бумаги диаметром 6 мм, которую закладывали в проекцию бифуркации корней 1 моляра нижней челюсти крысы слева с щечной стороны до удаления, а после — в проекцию лунки удаленного зуба с щечной стороны на 1 мин [2].

Использовали два метода допплерографии (рис. 2) для получения более объективной информации, так как показано, что при измерении кровотока в мягких тканях сравнение этих методов дает сходные результаты [7]. Однако использование комбинированного метода допплерографии дает возможность неинвазивной оценки кровотока в костной ткани (Патент на изобретение №2691305) [8].

Статистическую обработку осуществляли с применением программного обеспечения IBM SPSS Statistics 20 (США). Использовали U-критерий (Манна—Уитни). Статистическую достоверность определяли при p<0,05.

Результаты

При исследовании кровотока в пародонте крыс до начала введения препаратов ЗК была отмечена следующая динамика на аппликацию ацетилхолина: прирост кровотока начинался с 1-й минуты после окончания воздействия ацетилхолина, на 2-й минуте достигал максимальных значений, после чего снижался и достигал исходного уровня к 5-й минуте (рис. 3, табл. 1).

Изменения ацетилхолин-индуцированной реакции сосудов в пародонте крысы, полученные с помощью метода ЛДФ, имели такую же динамику (рис. 4, табл. 2).

Введение физиологического раствора в течение 6 нед не изменило характер реактивности сосудов пародонта крысы на аппликацию ацетилхолина, что было подтверждено с помощью обеих методик регистрации кровотока — УЗДГ и ЛДФ. После 6-недельного применения ЗК динамика реакции сосудов микроциркуляции пародонта изменилась. Так, при исследовании методом УЗВД максимальный прирост кровотока составил 120±5%, что достоверно ниже по сравнению с контрольной группой (147±6%). В группе ЗК + СД максимальный подъем амплитуды достиг 131±7% (физиологический раствор — 147±6%, 6 нед ЗК — 120±5%) (см. рис. 3, 4), что было также достоверно ниже по сравнению с группой, которой вводили физиологический раствор, но выше по сравнению с группой ЗК.

Мы оценили кровоток в кости нижней челюсти на финальном исследовании микроциркуляции (63-й день эксперимента) по методу, описанному нами ранее.

Для расчета использовали следующую формулу:

где Uвк — значения микроциркуляции толщины слоя кости, полученные УЗ-методом, L₁ — исходные показатели методом ЛДФ, U₁ — исходные показатели УЗДГ, L₂ — показатели ЛДФ после аппликации ацетилхолина, U₂ — показатели УЗДГ после аппликации ацетилхолина.

Исходя из полученных расчетов, показатели кровотока в костной ткани составили:

— группы контроля:

Uвк1=1,25U₁–8,61L₁(1,84U₂–1,25U₁)/(13,92L₂—8,6L₁)=0,89±0,1 [мл/с/см³];

— группы ЗК:

Uвк2=0,55U–5,42L₁(0,66U₂—0,55U₁)/(6,99L₂—5,42L₁)=0,52±0,2 [мл/с/см³];

— группы ЗК + cулодексид:

Uвк3=0,91U–7,72L₁(1,19U₂–0,91U₁)/(10,96L₂–7,72L₁)=0,82±0,2 [мл/с/см³].

Таким образом, по расчетам показатели кровотока в костной ткани составили в группе контроля 0,89±0,1 мл/с/см³, в то время как в группе животных, получающих ЗК, кровоток был достоверно снижен до 0,52±0,2 мл/с/см³ (p=0,03). Применение сулодексида улучшило состояние кровотока в кости, который был достоверно выше (0,82±0,2 мл/с/см³), чем у группы животных, получающих только ЗК (0,52±0,2 мл/с/см³), и не отличался от такового в группе контроля (0,89±0,1 мл/с/см³). Таким образом, мы получили данные, которые показали, что на фоне введения ЗК происходит снижение не только реактивности микрососудов слизистой оболочки, но и кровотока в костной ткани нижней челюсти крысы, а введение сулодексида нормализует состояние микроциркуляции в ткани пародонта.

Рентгенологические изменения нижней челюсти крыс на 3D-компьютерных томограммах в контрольной группе животных в альвеолярной части нижней челюсти в проекции удаленных зубов нарушения структуры плотности костной ткани не наблюдали. Трабекулярность рисунка кости нижней челюсти была однородной, края лунки удаленного зуба — с четкими ровными контурами, нарушений целостности кортикальной костной пластинки выявлено не было. Средний объем дефекта кости нижней челюсти у контрольной группы крыс (n=9) составлял 0,53±0,09 см³ (рис. 5, табл. 3).

В опытной группе на 3D-компьютерных томограммах в проекции удаленных моляров альвеолярной части нижней челюсти выявлены участки разряжения плотности костной ткани; участки, подозрительные на секвестрацию, визуализируются дефекты кортикальной замыкательной пластинки. Средний объем дефекта кости нижней челюсти у опытной группы крыс составлял 6,91±0,69 см³. Различия между контрольной и опытными группами были статистически значимы (p<0,05).

В 3-й группе исследуемых животных на 3D-компьютерных томограммах в зоне удаленных моляров альвеолярной части нижней челюсти выявлено следующее: структура костной ткани более однородна, секвестрация отсутствует, меньше протяженность деструкции кортикальной замыкательной пластинки в сравнении с опытными группами. Средний объем дефекта кости нижней челюсти у опытных групп крыс составлял 1,43±0,46 см³.

На гистологических срезах в контрольной группе животных изменений структуры кости альвеолярной части нижней челюсти в области удаленных зубов не наблюдали. Отмечена типичная картина гистологического строения кости на фоне повреждения костной ткани: костные балки обычного гистологического строения, губчатое вещество в области удаленного зуба было сохранным. У группы животных, которым вводили ЗК, наблюдали разрастание рыхлой волокнистой ткани, имелась афункциональная костная структура с неравномерным чередованием компактной и губчатой тканей, паретическим расширением сосудов, единичными дистрофическими костными балками с отечными межбалочными пространствами. Данные признаки указывают на асептическую природу некротического и воспалительного процессов. У животных группы ЗК + сулодексид костные балки были утолщены без дистрофических изменений. Признаки резорбции кости кортикальной пластинки были минимальными. Наблюдали незначительное замещение рыхлой волокнистой тканью губчатого вещества кости (рис. 6).

Результаты и обсуждение

Шестинедельное введение ЗК и последующее удаление зуба приводили к развитию остеонекроза нижней челюсти у крыс опытной группы, что подтверждалось как с помощью компьютерной томографии, так и гистологически. Кроме того, в ткани пародонта наблюдали снижение эндотелий-зависимой реакции сосудов, а также уменьшение кровотока в костной ткани нижней челюсти. Мы предполагаем, что нарушение трофики тканей пародонта является важным механизмом развития бисфосфонатного остеонекроза, что согласуется с данными R. Marx [2] и подтверждает данные, касающиеся патологического воздействия бисфосфонатов на соединительную ткань и микроциркуляцию [9—11]. Введение сулодексида приводило не только к снижению выраженности остеонекроза, но и к улучшению состояния кровотока, так как частично восстанавливалась реактивность микрососудов слизистой оболочки на аппликацию ацетилхолина, практически полностью восстанавливался кровоток в костной ткани. Полученные нами данные подтверждают положительное влияние сулодексида на профилактику развития бисфосфонатного остеонекроза. Вероятнее всего, сулодексид улучшает состояние эндотелиального гликокаликса и уменьшает тромбообразование в микрососудах, что имеет важное значение в механизме развития бисфосфонатного остеонекроза [4].

Таким образом, наши данные свидетельствуют о сосудистых нарушениях, возникающих в пародонте при введении ЗК, которые проявляются в виде снижения микроциркуляции в слизистой оболочке и костной ткани. Нарушение микроциркуляции в ткани пародонта и развитие эндотелиальной дисфункции являются важными патогенетическими звеньями развития бисфосфонатного остеонекроза. Применение сулодексида достоверно улучшает состояние микроциркуляции в ткани пародонта и уменьшает выраженность костного повреждения, что позволяет рассматривать лечение этим препаратом в качестве одного из направлений в предупреждении бисфосфонат-индуцированного остеонекроза.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.