Одной из наиболее актуальных проблем хирургической стоматологии по-прежнему остается совершенствование методов профилактики, диагностики и лечения инфекционных воспалительных заболеваний челюстно-лицевой области. Это связано с сохраняющейся высокой частотой этих заболеваний в общей структуре стоматологической заболеваемости, увеличением числа случаев развития атипично протекающих форм воспаления, развивающихся на фоне нарушенной реактивности организма и изменяющихся свойств микроорганизмов, постоянно приспосабливающихся к новым условиям существования [5, 7].

По данным современной литературы, базирующейся на результатах бактериологического исследования, наиболее часто встречающийся анаэробный компонент микробных ассоциаций при воспалительных процессах челюстно-лицевой области — представители группы бактероидов (преимущественно относящиеся к родам Porphyromonas, Prevotella) — на их долю приходится от 19 до 23% случаев. Реже встречаются фузобактерии и пептострептококки — 8—16%, а также вейлонеллы, пропионибактерии, эубактерии и извитые формы — 4—10% случаев [3, 4, 6, 7].

Однако известны вирулентные виды бактерий, обнаруживаемые в полости рта, как правило, пародонтопатогенной группы, которые невозможно или трудно идентифицировать традиционным бактериологическим методом исследования, даже с применением техники анаэробного культивирования [1, 2].

Так, выявление таких видов, как Treponema denticola, Eikenella corrodens, Capnocytophaga spp. затруднено в связи с ограниченной возможностью их культивирования на питательных средах. Есть определенные сложности и при выделении основных пародонтопатогенных видов — Porphyromonas gingivalis и Tannerella forsythia [1, 6]. Кроме того, при использовании анаэробного метода культивирования, диагностика нередко бывает малоэффективной, поскольку занимает продолжительное время — 5—7 сут и более. Особенности транспортировки материала, необходимость использования большого количества питательных сред, газовых смесей для культивирования, использование специальных идентификационных систем — все это является недостатками традиционного метода, так как усложняет и затрудняет процесс клинико-лабораторного исследования, увеличивает вероятность диагностических ошибок [1, 4].

Отсутствие возможности проведения современной и своевременной диагностики при данной патологии создает трудности в выборе адекватной антибактериальной терапии и создает предпосылки для развития грозных осложнений. В связи с тем литература по использованию молекулярно-генетического метода малочисленна и ограничивается несколькими сообщениями в отечественной и зарубежной печати, изучение эффективности данного метода диагностики при одонтогенных воспалительных процессах является актуальной задачей современной хирургической стоматологии и челюстно-лицевой хирургии [1, 6, 7].

Цель исследования: оценить эффективность молекулярно-генетического метода диагностики одонтогенных воспалительных процессов челюстно-лицевой области с применением разных наборов реагентов для выявления молекулярных маркеров пародонтопатогенных бактерий 1-го и 2-го порядка.

Обследованы 32 пациента (18 мужчин и 14 женщин) в возрасте от 18 до 56 лет. Пациенты были госпитализированы с диагнозом одонтогенной флегмоны дна полости рта (19 пациентов) и флегмоны подчелюстной области (11 пациентов) в отделение центральной стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Московского государственного медико-стоматологического университета (МГМСУ) им. А.И. Евдокимова и отделение хирургической стоматологии ГКБ № 36, где им оказывали ургентную медицинскую помощь.

Под внутривенным наркозом и местной анестезией Sol. Lidocaini 0,5% — 10—30 мл производили разрез кожи длиной 5—10 см, отступя от нижнего края челюсти на 2,0 см. Послойно рассекали подкожную клетчатку, платизму. Полутупым путем проходили в подчелюстное, подподбородочное, крылочелюстное пространства пораженной стороны, получали гнойное отделяемое. Раны дренировали трубочными дренажами, которые фиксировали йодоформным тампоном. Накладывали асептическую повязку.

Отбор проб для исследования (гнойный экссудат), в соответствии с протоколом фирмы производителя тест-систем, проводили бумажными чипами, которые помещали в пробирки Эппендорфф с подготовленным стерильным физиологическим раствором. Материал для исследования доставляли в лабораторию кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ им. А.И. Евдокимова в течение 2 ч.

Для осуществления полимеразной цепной реакции (ПЦР) использовали отечественный амплификатор, в который помещали пробирки с реакционной смесью, а также ультрацентрифуги, термошейкеры и другое необходимое оборудование. Учет результатов проводили в агарозном геле. Результаты исследования материала были доступны для анализа уже через 12—24 ч.

Как известно, ПЦР — искусственный процесс многократного копирования (амплификации) специфической последовательности ДНК, осуществляемый in vitro. Амплификацию ДНК выполняли термостабильным ферментом ДНК-полимеразой при 72 °C. Начало синтеза новой цепи ДНК инициировали специфическими праймерами — «затравочными» олигонуклеотидами. Праймеры ограничивали копируемый участок с двух сторон, связываясь с противоположными цепями ДНК-мишени. Праймеры были ориентированы таким образом, что синтез с помощью полимеразы протекал только между ними, удваивая количество копий этого участка ДНК [1, 2].

Для выделения ДНК из исследуемого материала использовали вариант пробоподготовки с помощью набора реагентов ГенЛаб (Россия), включающего: экстраген — суспензию смеси гранул ионообменников (1 флакон, 10 мл); энзимикс, протеолитический комплекс (1 пробирка с лиофилизированным содержимым), растворитель энзимикса (1 пробирка, 100 мкл). Дальнейшее выделение и детекцию ДНК пародонтопатогенных бактерий осуществляли в соответствии с медицинской технологией ФС-2006/043-У, разработанной на кафедре микробиологии, вирусологии, иммунологии МГМСУ [1].

Анализ молекулярных маркеров методом ПЦР-диагностики проводили с учетом рабочей классификации пародонтопатогенных видов, позволяющей разделить их по значимости в патологии пародонта на виды 1-го и 2-го порядка [2]. Соответственно выявление молекулярных маркеров трех основных видов пародонтопатогенов 1-го порядка: Aggregatibacter actinomycetemcomitas, Porphyromonas gingivalis, Tannerella forsythia, и двух пародонтопатогенов 2-го порядка — Prevotella intermedia, Treponema denticola — осуществляли, используя отечественную систему МультиДент-5. Выявление еще шести видов пародонтопатогенов 2-го порядка: Peptostreptococcus micros, Fusobacterium nucleatum/periodonticum, Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Eikenella corrodents, Capnocytophaga spp. (S. gingivalis, C. ochraces, C. sputigena) проводили с использованием тест-системы Micro-Ident plus.

Одновременно выполняли бактериологическое исследование с применением техники анаэробного культивирования в анаэростатах с бескислородной газовой смесью. Для получения демонстраций готовили мазки из выделенных чистых культур и осуществляли микрофотографирование с использованием цифровой техники микроскопа Eclips.

Статистическую обработку результатов проводили методами непараметрической статистики с использованием критерия Манна—Уитни.

При проведении молекулярно-биологических исследовании нами были проанализированы результаты частоты обнаружения бактериальных видов пародонтопатогенной группы в гнойном экссудате, полученном у пациентов при ургентном хирургическом лечении (вскрытии и дренировании) одонтогенных флегмон челюстно-лицевой области (см. таблицу).

В результате проведенного исследования получили следующее процентное соотношение по 11 бактериальным видам. Как видно из таблицы, такой приоритетный пародонтопатоген 1-го порядка и частый возбудитель гнойно-воспалительных процессов полости рта, как Aggregatibacter actinomycetemcomitas, выделяли из полученного гнойного экссудата в 26,6% случаев. Другой пародонтопатогенный вид 1-го порядка Porphyromonas gingivalis выявлен у 46,6% пациентов. Максимальная частота установлена для пародонтопатогенного вида 1-го порядка Tannerella forsythia — у 73,3% пациентов.

Частота выявления пародонтопатогенных видов 2-го порядка была значительно ниже, за исключением двух возбудителей — Prevotella intermedia, который был идентифицирован нами в 66,6% случаев и Fusobacterium nucleatum/periodonticum, который обнаружили в гнойном экссудате в 40% случаев.

Частота выявления молекулярных маркеров вида Treponema denticola составляла 20%, в то время как молекулярные маркеры остальных пародонтопатогенных видов 2-го порядка (Campylobacter rectus, Eubacterium nodatum, Eikenella corrodents, Capnocytophaga spр.) не были выявлены ни у одного пациента.

Полученные данные были подтверждены для культивируемых возбудителей при бактериологическом методе исследования. На рисунке представлены фотографии препаратов чистых культур анаэробных бактерий F. nucleatum, T. forsythia, полученные с помощью цифровой камеры микроскопа Eclips.

Сочетание новых подходов к диагностике и лечению одонтогенных воспалительных процессов позволяет повысить эффективность оказания ургентной медицинской помощи пациентам. Большие возможности в диагностике одонтогенных инфекций открывает молекулярно-генетический метод исследования. ПЦР, лежащая в основе данного метода, позволяет многократно умножить за несколько часов специфический фрагмент молекулы ДНК возбудителя и обнаружить его в исследуемом материале даже при незначительном количестве последнего. При этом нет необходимости соблюдать особые условия стерильности взятия материла, практически нет ограничений по времени и способу доставки материала в лабораторию.

Использование молекулярно-биологического метода диагностики позволяет в течение 12—24 ч с момента оказания ургентной помощи определить видовой состав микрофлоры. Высокая чувствительность метода, быстрота получения результатов обусловливают высокую эффективность данной методики при диагностике воспалительных процессов головы и шеи.

Как показали наши исследования, набор праймеров, содержащихся в отечественной системе МультиДент-5, имеет больше перспектив для диагностики одонтогенных процессов по сравнению с немецкой системой Micro-Ident plus, так как праймеры пародонтопатогенных видов 2-го порядка этой тест-системы не выявляли соответствующих возбудителей, за исключением Fusobacterium nucleatum/periodonticum, который обнаруживали в гнойном экссудате в 40% случаев.

В заключение необходимо подчеркнуть, что возможность оперативно получить результаты молекулярно-биологического исследования позволяет врачу быстро и точно подобрать антибактериальную терапию пациенту.