Единство морфофункциональной организации слизистой оболочки верхних дыхательных путей предполагает наличие общих этиопатогенетических и морфогенетических закономерностей развития воспалительных и полипозных изменений на разных уровнях дыхательного тракта, приближая проблему полипоидной гиперплазии голосовых складок гортани к проблеме полипоза носа и делая полипоз голосовых складок (с известными оговорками) одной из проблем ринологии.

Полипозная гиперплазия голосовых складок представлена группой наиболее распространенных форм доброкачественных образований области пространства Рейнке - отечными и ангиоматозными полипами, голосовыми узелками, отечным ларингитом Рейнке, - которые составляют от 30 до 70% всех причин нарушения голоса [1, 2]. Современная патологическая анатомия трактует их как «опухолеподобные поражения», морфологическую основу которых составляет локальный отек и микроциркуляторные расстройства в области мембранозной части голосовых складок, известной как пространство Рейнке. В патогенезе микроциркуляторных расстройств ведущую роль играет повреждение сосудистой стенки, вероятнее всего гипоксического генеза, вызванное повышенной голосовой нагрузкой («певческие узелки», «узелки проповедников»). Скоплению отечной жидкости в рыхлой соединительной ткани пространства Рейнке способствует также недостаточность отведения тканевой жидкости по слабо развитым лимфатическим коллекторам, которые должны преодолеть более плотные ткани голосовой связки и голосовой мышцы, а также «обойти» пластинки щитовидного хряща, чтобы соединиться с лимфатическими сосудами подскладочного и надскладочного отделов слизистой оболочки гортани. Дискутабельным остается вопрос о роли воспаления в патогенезе полипозной гиперплазии, хотя инфекционные факторы и неблагоприятное воздействие различных химических раздражителей на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, в том числе табакокурение, рассматриваются в качестве возможных этиологических факторов отечного ларингита [1-3].

На сегодняшний день полипы голосовых складок относят к группе доброкачественных экссудативных поражений голосовых складок [4]. Особняком стоит подгруппа, известная как отечно-полипозный ларингит, или болезнь Рейнке-Гайека (она же отек Рейнке), имеющий специфическую зону формирования «новообразования», а именно всю мембранозную часть голосовых складок обычно асимметричного вида. Стойкий отек пространства Рейнке напрямую указывает на недостаточность дренажной лимфатической системы мембранозной области голосовых складок. Изучение роли конституциональных и гормональных факторов (гипотиреоидизм) в патогенезе отека Рейнке также остается в сфере интересов клиницистов и патоморфологов [1, 4, 5].

Хотя этиология заболевания изучена в достаточной мере, а подходы к диагностике и лечению в общих чертах определены, тонкие механизмы развития нарушения микроциркуляции в ткани голосовых складок и повышения сосудистой проницаемости остаются до конца непонятыми. В то же время морфогенетический аспект полипоза голосовых складок, способствующий пониманию процесса формирования полипов, необходим для разработки новых подходов к тактике лечения и профилактике голосовых полипов, а также для обеспечения более благоприятного прогноза заболевания у лиц голосовых профессий. Целью данного фрагмента работы явилось изучение морфогенеза полипоза голосовых складок на основе комплексного клинического, гистологического и иммуногистохимического исследования оперативно удаленной полипозной ткани при хирургическом лечении голосовых полипов и полипозно-отечного ларингита.

Материалом исследования служили образцы полипозной ткани голосовых складок, полученные эндоларингеальным микрохирургическим способом от 31 пациента (13 из которых - мужчины, 18 - женщины) в возрасте от 23 до 75 лет, оперированного по поводу полипоза голосовых складок в период с 2008 по 2012 г. Подавляющее большинство пациентов составили лица, испытывающие повышенную голосовую нагрузку (педагоги, вокалисты, командный состав и другие). В анамнезе у 19 пациентов имела место бытовая интоксикация (табакокурение), у 7 - производственная химическая вредность. Среди них клинически диагностированы как ангиоматозные полипы голосовой складки - в 7 случаях; отечно-полипозный ларингит (отек Рейнке-Гайека) - у 7 пациентов; полип голосовой складки (неутонченная форма) - у 13; множественные полипы голосовых складок (неутонченная форма) - у 4 больных.

Весь материал фиксировали в нейтральном формалине, заливали в парафин по общепринятой методике. Для морфологического исследования гистологических срезов толщиной 5-7 мкм, помимо обзорных методов окраски гематоксилином и эозином, применяли специальные: окраска по Ван-Гизону, альциановым синим, PAS-реакция. Параллельно проводили иммуногистохимические реакции с использованием диагностических моно- и поликлональных антител против искомых антигенов, определяющих структурную и биохимическую организацию полипа. В работе использовались основные дифференцировочные маркеры T- и B-лимфоцитов (CD3, CD4, CD8 и CD20, CD79a, производители «NeoMarkers» и «DAKO» соответственно), регуляторного ко-рецептора T-лимфо­цитов молекулы B7-1 (CD80, «Epitomics»), макрофагов (CD68, «DAKO»), высокомолекулярных цитокератинов (клон 34βE12, «DAKO»), маркеры toll-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9, «LifeSpan BioSciences»), маркеры эндотелия и матриксных металлопротеиназ (ММР), позволяющие оценить ангиогенез (CD34, «Euro-Diagnostica»), сосудистую проницаемость и ремоделирование соединительнотканного матрикса (VCAM-1, MMP1, MMP9, «BioGenex», «Novocastra», «DAKO»). Исследования выполнялись по запатентованным протоколам указанных фирм-производителей антител. При необходимости проводили температурную демаскировку антигенов. Для визуализации реакций использовали готовые тест-системы с универсальными вторичными антителами, меченными хромогеном (HRP-polymer Detection system, «BioGenex»). Позитивные результаты гистохимических реакций учитывали при наличии двух негативных (на специфичность реакции и отсутствие активности эндогенной пероксидазы) и одного внутреннего позитивного (на специфичность) контролей.

После гистологического исследования, результаты которого в ряде случаев не совпадали с клинической оценкой, все образцы ткани полипов, были разделены на три группы: 1-ю группу составили 15 наблюдений отечных полипов голосовых складок, среди них 4 образца имели строение переходной формы и были квалифицированы как отечно-ангиоматозные полипы, в одном наблюдении отечный полип отличался резко выраженным миксоматозом стромы (миксоидный полип); 2-ю - 11 наблюдений ангиоматозных полипов голосовых складок; в 3-ю группу вошли 5 наблюдений отечно-полипозного ларингита (отек Рейнке-Гайека).

Анализ данных гистологического исследования показал, что независимо от принадлежности к той или иной клинико-морфологической группе общим ведущим компонентом описанных полиповидных гиперплазий, несмотря на некоторые специфические различия в микроскопическом строении, явились микроциркуляторные расстройства в области пространства Рейнке с нарушением проницаемости стенок сосудов, развитием диффузного интерстициального отека и лимфостаза (рис. 1, а-г).

В группе ангиоматозных полипов определяющим микроскопическим признаком выступали сосудистые изменения. Основной составляющей полипа были кавернозно расширенные или щелевидные тонкостенные сосуды с характерной причудливой извитостью контуров, при этом во всех наблюдениях присутствовали расстройства кровообращения. В просвете большинства сосудов определялись стазы крови и тромбы. Характерными находками были диапедезные кровоизлияния, а также выход в интерстиций плазменных белков с формированием плотных белковых масс. Часто наблюдались отложения в строму пигмента гемосидерина: в таких участках отмечалась клеточная реакция и признаки склерозирования. В 8 из 11 ангиоматозных полипов выявлены реактивные изменения покровного многослойного эпителия в виде умеренного акантоза, гиперплазии базального и парабазального слоев с формированием гипер- и паракератоза, и появлением зернистого слоя, клетки которого содержали кератогиалин (см. рис. 1, г). В трех полипах обнаружена дисплазия покровного эпителия 2-й и 3-й степени. Койлоциты были обнаружены в покровном эпителии трех полипов, причем в двух из них наблюдались явные специфические признаки герпетической инфекции со спонгиозом эпителия, формированием интраэпителиальных и субэпидермальных пузырей, выполненных серозной жидкостью с примесью лимфоидных клеток и сегментоядерных лейкоцитов. Как таковую воспалительную инфильтрацию в строме полипов мы наблюдали только в четырех полипах: в трех из них отмечено обострение воспаления, причем в двух - при наличии признаков герпетического поражения тканей полипа.

3-ю группу составили пять наблюдений хронического отечно-полипозного ларингита (болезнь Рейнке-Гайека), присланных для гистологического исследования в виде фрагментов слизистой оболочки голосовых складок, которая имела диффузную отечность или была представлена сливающимися полиповидными образованиями, располагавшимися, согласно клиническим данным, по краю одной или обеих голосовых складок (см. рис. 1, а). Гистологически покровный эпителий выглядел несколько утолщенным и отечным. В четырех наблюдениях эти изменения были связаны с его реактивной трансформацией и проявлялись в виде гиперкератоза, появления слоя кератогиалина: в одном случае - в сочетании с дисплазией 1-2-й степени, в другом наблюдении - с явлениями акантоза многослойного плоского эпителия. В строме полипов также наблюдался выраженный отек на фоне немногочисленных расширенных, переполненных отечной жидкостью, содержащей лимфоидные клетки, тонкостенных лимфатических сосудов. На фоне интерстициального отека в одном из тканевых образцов были обнаружены субэпидермальные и интраэпидермальные пузыри, заполненные прозрачным содержимым с единичными лейкоцитами, что в сочетании с выраженным койлоцитозом, указывало на возможную вирусную природу этих изменений, вероятно герпетическую (см. рис. 1, б, в). Очаговое скопление койлоцитов в покровном эпителии определялось еще в двух образцах полипозно-измененной слизистой оболочки. Воспалительные изменения в тканевых образцах присутствовали у двоих пациентов и носили характер хронического диффузно-очагового слабо выраженного серозного воспаления. Четкие признаки обострения воспалительного процесса в виде неравномерно рассредоточенной в отечной жидкости инфильтрации сегменто­ядерными нейтрофильными и эозинофильными лейкоцитами были выявлены в наблюдении с микроскопической картиной вирусного поражения ткани, предположительно герпетической природы. В строме всех образцов в той или иной степени были выражены явления фиброматоза, чаще в виде формирующихся соединительнотканных тяжей и очагового склероза.

Наличие периваскулярных плазморрагий и диапедезных кровоизлияний в образцах 1-й группы (переходная форма - отечно-ангиоматозные полипы) указывает на то, что строгую границу между ангиоматозным и отечным полипами, с одной стороны, и болезнью Рейнке-Гайека, с другой, провести нельзя, и что различия между ними определяются скорее степенью локальной васкуляризации, т.е. развитием очагов ангиоматоза, чем степенью порозности сосудистой стенки. Этот факт указывает на общность патогенетических механизмов нарушения сосудистой проницаемости и микроциркуляторных расстройств и закономерно ставит вопрос о ведущей роли воспаления в их развитии. Полученные нами гистологические данные не отрицают участия воспаления в развитии полиповидных гиперплазий и даже подтверждают в определенной части наблюдений серозный (а не гнойный) характер воспаления, возможно вирусной природы (койлоцитоз, морфологические признаки герпесвирусной инфекции). Однако в подавляющем большинстве исследованных полиповидных гиперплазий голосовых складок признаков текущего воспаления с лейкоцитарной реакцией найдено не было. Возможное объяснение этому феномену, приближенное к пониманию механизмов развития микроциркуляторных расстройств, было получено нами после выполнения иммуногистохимического исследования, результаты которого приводятся суммарно для всех трех групп.

Иммуногистохимическое фенотипирование лим­­фо­идных клеток показало, что немногочисленные лимфоциты в составе субэпителиальной ткани, а также среди интраэпителиальных мононуклеарных клеток являются CD3-позитивными T-клетками в основном хелперного типа (CD4⁺). Единичные клетки супрессорно-цитотоксической популяции (CD8⁺) встречались главным образом в наблюдениях с признаками вирусной инфекции. Лимфоциты с фенотипом B-клеток (CD20⁺, CD79a⁺) встречались в очаговых субэпителиальных скоплениях, где при окраске гематоксилином и эозином присутствовали немногочисленные плазматические клетки. Преобладание тканевого отека, рассредоточенность клеток воспаления и общая скудность клеточной реакции не позволили дать количественную оценку представительства отдельных популяций. В то же время следует особо отметить, что в случаях с реактивными гиперпластическими изменениями покровного эпителия, где присутствовали интраэпителиальные лимфоциты, нам удалось наблюдать не описанный ранее феномен экспрессии клетками нелимфоидной пограничной ткани одного из ключевых протеинов, участвующих в иммуномодулирующих процессах. Так, клетки эпителия базального и супрабазального слоев иногда вплоть до середины шиповатого слоя обнаруживали четкую цитоплазматическую экспрессию CD80(B7-1) молекулы (рис. 2).

«Заинтересованность» покровного эпителия в развитии реактивного состояния слизистой оболочки голосовой складки проявлялась также в виде мембранной экспрессии toll-подобных рецепторов - TLR2 и TLR4, а также эндосомальной экспрессии TLR9 эпителиоцитами базального и супрабазального слоев эпителиального покрова полипов (рис. 3).

В случаях с присутствием в экссудате нейтрофильных лейкоцитов столь же четко выявлялась экспрессия TLR4, который распознает присутствие грамотрицательной бактериальной флоры (рис. 5).

При исследовании механизмов развития стромального отека и для четкой визуализации стенок сосудов и эндотелия мы использовали иммуногистохимическое выявление СD34-антигенов, а также молекул адгезии эндотелия сосудов VICAM-1. По полученным данным, характерный для всех групп отек эндотелия и его базальной мембраны, указывающий на нарушение их проницаемости, сопровождался экспрессией молекулы VICAM-1, которая была неоднозначной по уровню выраженности (степени окрашивания) и вовлеченности разных участков стенки микрососудов. Использование маркера CD34 позволяло визуализировать очертания кровеносного микроциркуляторного русла и лимфатических сосудов с явлениями лимфостаза и отличать их от артефициальных структур интерстициального отека в виде щелей, полостей, «озер», образованных разволокнением и расхождением коллагеновых и ретикулярных волокон под давлением отечной жидкости (рис. 6).

Васкуляризация стромы отечных полипов и фрагментов ткани голосовых складок при отеке Рейнке-Гайека по сравнению с ангиоматозными полипами была развита слабо и представлена, в основном, сосудами капиллярного и синусоидного типов, которые зачастую трудно дифференцировать при рутинном окрашивании гематоксилином и эозином от лимфатических коллекторов, если они не заполнены клетками красной крови. Иммуногистохимическое исследование с использованием маркеров CD34 и VCAM-1 позволило получить максимально точное представление о реальном наличии этих структур и дифференцировать их от вышеупомянутых имитирующих сосуды «структур» интерстициального отека.

Можно предположить, что в формировании столь значительных нарушений микроциркуляции в тканях полипов, неизбежно ведущих к гипоксии, дистрофии тканей и, следовательно, к формированию фиброза, присутствуют механизмы, отвечающие за процессы ремоделирования соединительнотканного матрикса. В настоящее время уже известно, что MMP играют значительную роль не только в норме в ходе эмбриогенеза, физиологической регенерации, но и при патологических процессах [9, 10]. Известно, например, что ММP-9 (желатиназа), обладает способностью разрушать трехспиральные структуры коллагена IV и V типов. Поскольку коллаген IV типа является основной составляющей базальных мембран эпителиев и эндотелиальной выстилки микрососудов, активность ММP-9 рассматривается как один из ведущих факторов, регулирующих проницаемость базальных мембран для жидкостных и форменных элементов крови, лимфы и перемещения тканевой жидкости. При иммуногистохимическом исследовании мы наблюдали экспрессию ММР-1 и ММР-9 на эндотелиальных клетках, фибробластах, клетках воспалительной инфильтрации, а также экстрацеллюлярной локализации (рис. 7).

При обсуждении итогов проведенного исследования особого внимания в структуре полипов голосовых складок заслуживает оценка состояния покровного многослойного плоского неороговевающего эпителия. Более чем в половине всех наблюдений (n=18, или 58%) найдены изменения эпителиального пласта в виде его утолщения не столько за счет отека, сколько в результате гиперплазии эпителиоцитов и развития патологического ороговения в форме гипер- и паракератоза с появлением зернистого слоя клеток, содержащих кератогиалин. В шести наблюдениях из 18 выявлена дисплазия эпителия 1-й и 3-й степени, в трех случаях - явления акантоза. Данные морфологические изменения наблюдались преимущественно у курящих пациентов и/или регулярно контактирующих с химическими вредностями, при этом испытывающих перенапряжение голосовой функции. Таким образом, можно констатировать, что табакокурение и/или вдыхание химических раздражителей представителями профессий, испытывающих голосовое напряжение, усугубляет течение заболевания, способствуя развитию кератоза покровного эпителия и появлению его дисплазии. Это обстоятельство ставит вопрос об онкологической настороженности в отношении лиц, страдающих полипозом голосовых складок, поскольку кератоз и дисплазия эпителия рассматриваются как предраковые процессы.

Известно, что подобные гиперпластические изменения плоского эпителия могут возникать в условиях хронического воспаления, в частности при длительно текущем ларингите [11]. Тем не менее до сих пор вопрос о роли воспаления в формировании полипов остается открытым. Одной из причин нарушений микроциркуляции в тканях полипа, по мнению С.А. Карпищенко [2], является воспаление бактериальной природы. Очевидно, что в фокусе данного исследования находились только сами полипы, а участки окружающей ткани голосовых складок были редкой находкой, и оценить их было сложно. Для всех исследованных групп характерно, что воспалительная инфильтрация имела характер диффузно-очагового хронического неспецифического серозного, а не гнойного воспаления. Иммуногистохимическое фенотипирование эффекторных клеток инфильтрата (CD3, CD79a, CD68) подтвердило серозный характер экссудации, а продуктивный компонент в некоторых наблюдениях присутствовал как признак организации очагов кровоизлияний в ангиоматозных полипах.

Преимущественно серозный характер экссудации указывает скорее на вирусную, чем бактериальную инфекцию, что согласуется с выявлением в 10 наблюдениях койлоцитов в составе покровного эпителия полипов или в случайно попавших фрагментах здоровой ткани голосовой складки, а также с морфологическими признаками герпетической инфекции в виде субэпидермальных пузырей и интраэпидермального акантолиза. Косвенным подтверждением вирусного присутствия является также высокая экспрессия клетками плоского эпителия и эндотелия сосудов микроциркуляции в полипах toll-подобного рецептора 9 (TLR9), который распознает вирусную ДНК, имеющую частые повторы CpG-мотива [12, 13]. Известно, что эпителий респираторного тракта наиболее подвержен цитопатическому влиянию вирусов, особенно часто у иммуноскомпрометированных пациентов. Показано, что вирусы, в частности семейства герпесвирусов (например, цитомегаловирус), вызывают нарушение микроциркуляции крови, часто проявляющиеся в виде тромботической микроангиопатии [14]. По данным нашего исследования, в 40% случаев полипы с гистологическими признаками вирусного повреждения тканей имели выраженные расстройства микроциркуляции в виде тромбозов с плазматическим пропитыванием стенок сосудов, диапедезных кровоизлияний, в ряде случаев в сочетании с признаками герпетической инфекции. Подобные нарушения проницаемости с развитием диапедеза, интерстициального отека и лимфостаза находят объяснение в наблюдавшейся нами экспрессии металлопротеиназ 1-го и 9-го типов, которые активируются провоспалительными цитокинами, действующими на неактивный предшественник металлопротеиназ, и которые участвуют в деградации протеогликанов и коллагена [9]. Способность этих цинкзависимых эндопептидаз разрушать все типы белков внеклеточного матрикса проявляется также тем, что, участвуя в процессинге хемокинов и цитокинов, они осуществляют их деградацию, влияя тем самым на миграцию лейкоцитов и степень воспалительной реакции [15].

Полученные результаты неоспоримо свидетельствуют в пользу того, что любое патогенетическое построение для объяснения морфогенеза полипоза голосовых складок будет упираться в эпителиально-стромальные взаимодействия. Эпителий как пограничная ткань, непосредственно обращенная во внешнюю среду и первой принимающая на себя ее агрессивное воздействие, является инициатором реакций врожденного иммунитета, организуя с по­мощью toll-подобных рецепторов и их сигнальных путей немедленный воспалительный ответ через продукцию провоспалительных цитокинов. Эпителий же, экспрессируя ко-стимулирующую молекулу CD80(B7-1), инициирует активность клеток адаптивного иммунитета для участия в эффекторных функциях иммунной системы. Включение активности ММР, напрямую завязанных на провоспалительных цитокинах, является мощным фактором дезорганизации и организации межклеточного матрикса, включая базальные мембраны, регулятором процессов ангиогенеза, сосудистой проницаемости и репарации [9]. Не исключено, что картина редуцированного серозного воспаления (серозный отек с минимумом нейтрофильных лейкоцитов или их отсутствием), наблюдаемая при полипозе голосовых складок, является результатом антицитокиновой активности ММР [15].

Комплексное гистологическое и иммуногистохимическое исследование полипов голосовых складок, а также анализ анамнестических данных пациентов показал, что морфогенез полипоза голосовых складок достаточно сложен и основан на эпителиально-стромальном взаимодействии. В процессе формирования полиповидных гиперплазий значительную роль играют разнообразные нарушения микроциркуляции, причиной которых являются и анатомическая особенность строения пространства Рейнке-Гайека, и хроническая экзогенная интоксикация (табакокурение, контакт с химическими реагентами), особенно в сочетании с повышенными голосовыми нагрузками. Определенную роль, требующую дальнейшего исследования, играет цитопатическое действие вирусной инфекции как возможный пусковой механизм нарушений микроциркуляции, в первую очередь, проявляющихся повышенной проницаемостью сосудов и интерстициальным отеком в результате дезорганизации протеогликанов и коллагена в составе базальных мембран и межклеточного матрикса при участии ММР. В качестве основного активатора ММР, по-видимому, выступают провоспалительные цитокины, продукция которых определяется сигналами с toll-подобных рецепторов клеток покровного эпителия слизистой оболочки голосовых складок.

Выявленные эпителиально-стромальные взаимодействия, реализуемые через клетки врожденного и приобретенного иммунитета, подчеркивают инициирующую роль покровного эпителия, экспрессирующего толл-подобные рецепторы, в развитии реактивных полипоидных изменений слизистой оболочки голосовых складок. Следует полагать, что детекция возбудителей и сигнализация к экспрессии провоспалительных цитокинов с толл-подобных рецепторов эпителиальных клеток слизистой оболочки дыхательного тракта является тем общим патогенетическим звеном, которое срабатывает и при полипозных риносинуситах.

Конфликт интересов отсутствует.

Участие авторов:

Дизайн и концепция: В.Б.

Сбор и анализ клинического материала: Э.К.

Руководитель темы: Г.И.

Постановка иммуногистохимических реак­ций: И.Р.