Ранняя экспресс-диагностика опухолевых заболеваний кожи головы и шеи при микроспектроскопии комбинационного рассеяния света

Опухоли кожи являются распространенными заболеваниями, которые значительно снижают качество жизни пациентов и приводят к значительным финансовым потерям [1]. Особого внимания заслуживают базальноклеточная карцинома кожи (БКК), плоскоклеточная карцинома кожи (ПКК), меланома и др. [1, 2]. Как известно, пациенты часто обращаются за медицинской помощью на поздней стадии заболевания, что ведет не только к необратимому прогрессированию патологии, но и к выполнению инвазивных вмешательств и удлинению реабилитационного периода после проведенной операции [3].

В современной клинической медицине широко используются цитологический, гистологический методы диагностики, а также магнитно-резонансная томография, компьютерная томография, терагерцовая спектроскопия, оптическая когерентная томография и др. Каждый из представленных методов обладает своими плюсами и минусами [1, 4—9]. Одной из ключевых проблем в диагностике опухолей кожи является определение их границ.

Для лечения злокачественных заболеваний кожи применяются операции по Моосу, которые являются дорогостоящими, и для их проведения требуется использование специального оборудования и обученного высококвалифицированного персонала. Выполнение хирургического вмешательства без соответствующей навигации может приводить в дальнейшем к рецидиву опухоли и повторной, более обширной операции, поскольку в настоящее время не представляется возможным четко определять границы опухоли на основании клинического обследования и дерматоскопии. Например, трудности возникают при идентификации типов плоскоклеточных карцином, некоторых форм базальноклеточной карциномы (склеродермоподобной формы), ангиосарком и др.

Метод конфокальной микроспектрометрии комбинационного рассеяния света в дальнейшем может позволить определять четкие границы опухоли и избежать сложных операций и повторных хирургических вмешательств. Данный метод дает возможность оценить изменения, происходящие в ткани на уровне молекулярного состава, а также обладает такими характеристиками, как высокая точность, скорость, неинвазивность, чувствительность, специфичность при спектральном анализе новообразований кожи. Важным является использование неинвазивных методов [6, 8—15], в том числе для получения возможности не только идентифицировать тип патологического процесса, но и оценить границы резекции опухоли [16].

Цель исследования — изучить возможности использования конфокальной микроспектроскопии комбинационного рассеяния света и флюоресценции с длиной волны возбуждающего излучения 785 нм для дифференциальной диагностики новообразований кожи области головы и шеи.

Проведен анализ спектральных характеристик тканей при доброкачественных и злокачественных новообразованиях кожи. Всего проанализировано 1066 спектров интактной кожи, тканей БКК и ПКК кожи и доброкачественных новообразований кожи (дермальных невусов) (n=244; n=220, n=180, n=422 соответственно). Опухоли кожи локализованы в области кончика, ската и крыла носа, наружного слухового прохода и ушной раковины, в лобной и щечной анатомических зонах. Для конфокальной спектроскопии комбинационного рассеяния света и флуоресценции применяли аппаратно-программный комплекс конфокальный микроскоп-спектрометр комбинационного рассеяния света Confotec MR520, функционирующий на длине волны возбуждающего лазерного излучения 785 нм. Спектры сняты в условиях in vitro. Исследованы образцы тканей опухолей на стадии T1N0M0. В качестве метода сравнения применяли гистологическое исследование. Операции проведены в специализированном онкологическом отделении, лечение осуществляли в соответствии с действующими стандартами, порядками оказания медицинской помощи, клиническими рекомендациями. Изучаемый фрагмент ткани (интактной кожи, базальноклеточной карциномы и плоскоклеточной карциномы кожи, дермального невуса) диаметром до 2 мм помещали на столик сканирующего конфокального микроскопа с указанными выше характеристиками. Мощность излучения составила 2,2 мВт; время накопления сигнала — 10 с в каждой точке; среднее количество спектров на один образец — 15. В ходе исследования из результирующего спектра вычитали интенсивность сигнала флуоресценции с использованием алгоритма Ванкувера, затем проводили сглаживание методом Савицкого—Голея и нормировку на наиболее стабильную интенсивность полосы 1442 см^–1.

Проведение исследования одобрено межвузовским этическим комитетом (выписка из протокола № 3 от 16.03.2023).

После получения спектров флюоресценции и комбинационного рассеяния света БКК кожи, ПКК кожи, а также интактной кожи in vitro на длине волны возбуждающего излучения 785 нм проведена их обработка, затем каждый полученный спектр сопоставлен с данными гистологического исследования. На основе полученных данных проведено сравнение спектров при указанных заболеваниях между собой и со спектрами интактной кожи.

На рис. 1, а, б на цв. вклейке изображены спектры интактной кожи, БКК и ПКК в сравнении друг с другом при длине возбуждающего излучения 785 нм в диапазоне волновых чисел от 900 до 3100 см^–1.

Рис. 1. Спектры конфокальной микроспектроскопии комбинационного рассеяния света при длине волны возбуждающего излучения 785 нм.

а — в диапазоне волновых чисел от 900 до 1900 см–1 базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы и интактной ткани кожи; б — в диапазоне высоких волновых чисел от 2800 до 3100 см-1 базальноклеточной карциномы, плоскоклеточной карциномы и интактной ткани кожи. Синим цветом показаны спектры базальноклеточной карциномы, фиолетовым — плоскоклеточной карциномы, зеленым — интактной ткани кожи.

Наиболее информативными линиями комбинационного рассеяния света при регистрации спектров с поверхности невусов были следующие: 937, 1002, 1031, 1060, 1085, 1125, 1156, 1171, 1206, 1249, 1300, 1342, 1442, 1552, 1606, 1656, 1745 см^–1. При злокачественных новообразованиях регистрировались следующие линии комбинационного рассеяния света в данном диапазоне частот: 938, 1004, 1062, 1082, 1175, 1208, 1248, 1266, 1302, 1316, 1393, 1445, 1585, 1604, 1654, 1745 см^–1. Определены спектральные различия дермальных невусов в зависимости от накопления пигмента, главным образом меланина, а также отличие данных спектров от спектров при БКК, ПКК в сравнении с интактной кожей, не вовлеченной в опухолевый процесс (рис. 2 на цв. вклейке). Полученные результаты могут быть информативными в диагностике как пигментных, так и беспигментных доброкачественных и злокачественных новообразований.

Рис. 2. Спектры конфокальной микроспектроскопии комбинационного рассеяния света при длине волны возбуждающего излучения 785 нм.

Диапазон волновых чисел от 900 до 1900 см–1 дермального невуса с накоплением пигмента (показано коричневым цветом), дермального невуса без накопления пигмента (показано серым цветом) и интактной ткани кожи (показано зеленым цветом).

Как известно, интактная кожа состоит из трех основных слоев: эпидермального, дермального и гиподермы, или подкожного жирового слоя. При формировании новообразования кожи качественный и количественный составы ее компонентов изменяются. Так, при базальноклеточной карциноме и плоскоклеточной карциноме кожи при разрушении мембран клеток могут обнаруживаться специфические гистологические изменения, которые коррелируют с данными микроспектроскопии комбинационного рассеяния света (см. рис. 1, а, б).

Как известно, БКК кожи относится к одному из наиболее распространенных злокачественных новообразований кожи, которое может вызвать деструкцию местных тканей, при этом она редко метастазирует [17]. При анализе гистологических данных можно отметить, что БКК кожи представлена клетками с крупными удлиненными ядрами, а в клетках наблюдается выраженный процесс митоза и апоптоза, сопровождающийся лимфоцитарным воспалением. Визуализируются также большое количество фибробластов и утолщение волокон коллагена [18], что сопровождается усилением сигнала в диапазоне от 900 до 1900 см^–1 при длине волны 785 нм (см. рис. 1, а). Некоторые виды БКК имеют схожую гистологическую картину с компонентами ткани ПКК, что может отражаться в спектрах в виде линий комбинационного рассеяния света на одной и той же величине волнового числа [19—21], как продемонстрировано на рис. 1, а, б, однако пики могут различаться по интенсивности, полуширине и другим параметрам.

Известно, что ПКК относится к одному из наиболее распространенных форм немеланоцитарного рака кожи, на которую приходится 20% всех злокачественных новообразований кожи [17]. При сохранности базальной мембраны клеток некоторые пики комбинационного рассеяния света могут быть одинаковыми в норме и при ПКК, однако в данном случае следует анализировать все линии в совокупности, их характеристики: высоту, полуширину, сдвиг по оси абсцисс и др. (см. рис. 1а, б). При формировании такой опухоли развивается воспалительная реакция, состоящая из инфильтрации лимфоцитов, плазматических клеток и эозинофилов, окружающих стромальные сосуды и иногда проникающих в опухоль; эпидермис, покрывающий поверхность ткани при ПКК, в свою очередь, может быть изъязвлен, структура клеток нарушена, что и определяет различие спектральных данных в норме и при ПКК.

На рис. 1, а мы видим, что в указанном диапазоне величин волновых чисел на длине волны возбуждающего излучения 785 нм при БКК наиболее интенсивными линиями комбинационного рассеяния света являются 938, 1062, 1248, 1316, 1445, 1654 см^–1, при этом совпадение интенсивности линий наблюдается на величине волнового числа 1445 см^–1. При ПКК в данном диапазоне частот они также регистрируются, однако данные пики менее выражены по интенсивности, чем при БКК, а в норме они минимальные по сравнению с таковыми при БКК и ПКК. Такой феномен можно объяснить с позиций пересечения некоторых стадий опухолевого процесса при этих видах патологии. В указанном диапазоне величин волновых чисел и при указанной длине волны возбуждающего излучения наиболее информативными полосами комбинационного рассеяния света являются 938, 1004, 1062, 1082, 1175, 1208, 1248, 1266, 1302, 1316, 1393, 1445, 1585, 1604, 1654, 1745 см^–1.

В диапазоне волнового сдвига 936—940 см^–1 на длине волны возбуждающего излучения 785 нм отмечаются пики комбинационного рассеяния, свидетельствующие о наличии в тканях углеродных связей C—C, в том числе в составе белков (α-спираль), коллагена 11-го типа [22]. При длине волны возбуждающего света 785 нм в диапазоне волновых чисел 1000—1005 см^–1 отмечаются пики, иллюстрирующие наличие ν(C—C)-связей, растяжение ароматического кольца, наличие фенилаланина, белков (Phe), коллагена, эластина, кератина [22—24], соотношение которых меняется при появлении злокачественного роста при ПКК. В диапазонах величин волновых чисел 1060—1064 см^–1 и 1080—1084 см^–1 соответственно (при длинах волн возбуждающего излучения 532 нм и 785 нм) визуализируются спектры, свидетельствующие о наличии связей ν(CC)–, ν(CN)– в составе триолеина, фосфолипидов, нуклеиновых кислот. При этом на величинах волновых чисел в диапазонах 1079—1085 см^–1 и 1126—1130 см^–1 отмечаются ν(CC)-скелетные трансконформации, ν(CN)-связи в составе фосфолипидов [23, 25]. В диапазонах волновых чисел 1208—1210 см^–1 и 1248—1250 см^–1 на длинах волн 532 нм и 785 нм соответственно отмечаются спектральные признаки амида III, белка (α-спирали), коллагена, эластина [26]. В диапазоне 1440—1454 см^–1 выявляемые спектры иллюстрируют наличие связей δ(CH₂), δ(CH₃) в составе липидов, белков (алифатических аминокислот, триолеина, церамидов [23, 25, 26]. При БКК в данном случае изменения в спектрах коррелируют с регистрацией пиков на уровне молекулярного состава. В диапазоне волновых чисел 1440—1450 см^–1 и 1554—1559 см^–1 регистрируется наличие ν(C= C)-связей в составе триптофана [25, 27]. На наличие амида I указывает полоса на величине волнового числа 1654 см^–1, которая характеризует α-спиральную структуру молекул. Помимо этого, можно предполагать, что на величине волнового числа 1654 см^–1 имеется вклад не только амидной полосы I белков, но и воды [28]. В диапазонах величин волновых чисел 1652—1656 см^–1 и 1743—1745 см^–1 отмечается наличие ν(C=O)-связей в составе липидов [23, 29]. Из спектральных особенностей следует отметить, что данные пики в норме и при БКК совпадали после обработки сигналов, однако были ниже по интенсивности при БКК, что можно объяснить травматизацией ткани при БКК, когда происходит разрушение ее компонентов.

На рис. 1, б продемонстрированы спектры в диапазоне высоких волновых чисел при длине волны возбуждающего излучения 785 нм. Наиболее интенсивные полосы комбинационного рассеяния света в норме отмечаются на величинах волновых чисел 2853 см^–1, 2880 см^–1, при этом при ПКК и БКК они также регистрируются, что свидетельствует о наличии схожих компонентов тканей при данных заболеваниях. В диапазонах волновых чисел 2929—2934 см^–1 и 2925—2933 см^–1 регистрируется асимметричное растяжение CH2-групп в составе липидов и белков. Пики комбинационного рассеяния света на величинах волновых чисел 2935 см^–1 и 2853 см^–1 являются характерными для метильных групп в белках и метиленовых групп в жирных кислотах [30]. Наиболее интенсивными полосами комбинационного рассеяния света при ПКК являются 2930 см^–1 и линии диапазона 2800—2825 см^–1. При БКК регистрируется пик с максимальной интенсивностью линии комбинационного рассеяния света на 3062 см^–1. При этом наиболее информативными полосами комбинационного рассеяния света являются 2853, 2880, 2930, 3011, 3040, 3062 см^–1.

При сравнении наиболее информативных полос комбинационного рассеяния света при дифференциации доброкачественных и злокачественных новообразований выявлены спектральные особенности. Так, на величинах волновых чисел 1266, 1316, 1393, 1585 см^–1при регистрации спектров с поверхности злокачественных новообразований обнаруживались пики, которых не было при регистрации спектров с поверхности дермальных невусов. При этом при снятии спектров с поверхности доброкачественных новообразований (пигментных и беспигментных дермальных невусов) также отмечены линии комбинационного рассеяния света, которые не прослеживались в случае идентификации злокачественного процесса: 1031, 1125, 1156, 1342, 1552 см^–1. В остальных случаях можно продемонстрировать сдвиг линий комбинационного рассеяния света вдоль оси абсцисс, при этом такие линии регистрировались как в случае злокачественного, так и в случае доброкачественного процесса в области кожи. Полученные данные свидетельствуют о том, что с использованием конфокальной спектроскопии комбинационного рассеяния света представляется возможным идентифицировать тип патологического процесса, провести экспресс-диагностику доброкачественных и злокачественных новообразований кожи, в том числе с определением границ резекции опухоли.

В результате исследования получены спектральные различия интактной ткани кожи, плоскоклеточной карциномы кожи, базальноклеточной карциномы кожи и дермальных невусов. По полученным данным представляется возможным дифференцировать эти заболевания между собой и от интактной ткани кожи. Использование конфокальной микроспектроскопии комбинационного рассеяния света, по-видимому, позволит в перспективе выявлять новообразование (плоскоклеточную карциному кожи или базальноклеточную карциному кожи) на стадии инициации онкологического процесса, а также определять границы резекции опухоли. Создание базы данных спектральных характеристик опухолей кожи и других новообразований с использованием комбинационного рассеяния света, коррелирующих с данными гистологического исследования, является важным вспомогательным инструментом врача при установлении диагноза и обеспечении своевременного направления пациента на рациональное лечение.

Вклад авторов: концепция, основная идея, методология и дизайн исследования — Тимурзиева А.Б., сбор и обработка материала — Тимурзиева А.Б., Федина М.С., Вертиева Е.Ю., Омарова А.Р., Римская Е.Н., Шелыгина С.Н.; статистический анализ данных — Тимурзиева А.Б., Римская Е.Н., Шелыгина С.Н., Сараева И.Н.; написание текста — Тимурзиева А.Б., Вертиева Е.Ю., Федина М.С., Попадюк В.И.; научное редактирование — Попадюк В.И.

Финансирование:работа выполнена при финансовой поддержке гранта Российского научного фонда, проект №23-25-00249.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution: concept, main idea, methodology and research design — Timurzieva A.B., collection and processing of material — Timurzieva A.B., Fedina M.S., Vertieva E.Yu., Omarova A.R., Rimskaya E.N., Shelygina S.N.; statistical data analysis — Timurzieva A.B., Rimskaya E.N., Shelygina S.N., Sarajeva I.N.; writing the text — Timurzieva A.B., Vertieva E.Yu., Fedina M.S., Popadiuk V.I.; editing — Popadiuk V.I.

Financial Support:by Russian Science Foundation, grunt number №23-25-00249.