Введение

Известно, что у женщин с незлокачественными заболеваниями молочной железы (НЗМЖ), такими как фиброаденома молочной железы (ФАМ) и фиброзно-кистозная мастопатия, имеется потенциальный риск злокачественной трансформации ткани молочной железы (ТМЖ) [1—4]. Формально ФАМ и ФКМ не считаются предраковыми заболеваниями и лишь в редких случаях могут переходить в злокачественные формы, однако поиск молекулярно-клеточных маркеров, позволяющих формировать группу риска с повышенной вероятностью злокачественного перерождения ТМЖ при ФАМ и ФКМ, представляется актуальным. В настоящее время к предраковым заболеваниям молочной железы относят склерозирующий аденоз, межпротоковые и междольковые пролифераты, а также радиальный рубец [5—7]. В то же время проведено недостаточно исследований, посвященных поиску прогностических маркеров, позволяющих оценивать индивидуальный вероятный риск у пациентов с НЗМЖ. Эти факты обусловливают перспективность исследований, направленных на выявление маркеров в ТМЖ при НЗМЖ, позволяющих оценивать вероятность возникновения рака молочной железы, что, по своей сути, можно отнести к проблемам профилактики злокачественных новообразований.

Одним из процессов, который допустимо рассматривать в качестве раннего этапа формирования в ТМЖ клеточной атипии и предиктора злокачественной прогрессии, является эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) [8—10]. Известно, что ЭМТ характеризуется потерей эпителиальными клетками их полярности, изменением клеточной адгезии, «переключением» экспрессии E-кадгерина на экспрессию N-кадгерина и приобретением способности к миграции и инвазии. Экспрессия мезенхимальных маркеров в клетках ТМЖ, таких как виментин, N-кадгерин и фибронектин, с соответствующей утратой эпителиального E-кадгерина является одним из проявлений ЭМП, предшествующего первым признакам клеточной атипии в молочной железе. Для раковых клеток, происходящих из эпителия, характерна аберрантная экспрессия N-кадгерина (гиперэкспрессия), которая способствует подвижности и инвазии пролиферирующих опухолевых клеток [10, 11]. Показано, что ЭМП в ТМЖ может быть ассоциирован с процессом формирования в популяции нормальных стволовых клеток (СК) субпопуляции раковых СК, активная пролиферация которых приводит к постепенной малигнизации ТМЖ при НЗМЖ и возникновению рака [12]. Об этом может свидетельствовать тот факт, что на клеточных мембранах СК рака молочной железы и на пролиферирующих клетках, выявляемых в зонах ЭМП, могут экспрессироваться одни и те же поверхностные молекулярные маркеры. К таким маркерам относятся CD24 и CD29 [13—15]. Показано, что клетки в популяции Lin-CD29^hiCD24⁺ являются мультипотентными и самообновляющимися, и это позволяет относить их к нормальным стволовым клеткам молочной железы. Установлено, что одна клетка с фенотипом Lin-CD29^hiCD24⁺, помеченная трансгеном lacZ, может воссоздать полноценную молочную железу in vivo [16, 17]. Вместе с тем мутантные линии раковых клеток BRCA1 содержат субпопуляцию CD24+CD29+, которую по ряду характеристик следует отнести к субпопуляции раковых стволовых клеток, и это согласуется с представлением о том, что стволовые клетки рака молочной железы могут происходить из нормальных стволовых клеток молочной железы [18].

Методами иммуногистохимического анализа показано, что в норме в ТМЖ маркеры CD24 и CD29 экспрессируются в миоэпителиальных клетках и железистых клетках эпителия [19, 20], а при дольковом раке (лобулярной карциноме) и протоковом раке (инвазивной карциноме) молочной железы — в большинстве опухолевых клеток [21, 22]. Важно, что эпителиальные клетки молочной железы, экспрессирующие CD24+ и CD29+, могут проявлять признаки перехода от эпителия к мезенхиме, что указывает на их непосредственное участие в процессе ЭМП и, следовательно, в малигнизации ТМЖ [23]. На основании всех перечисленных данных можно было предположить, что увеличение количества клеток, экспрессирующих CDH2, CD24 и CD29 в ТМЖ при НЗМЖ, может рассматриваться в качестве критерия формирования группы риска злокачественного перерождения ТМЖ.

Ранее в журнале Профилактическая медицина мы уже представляли исследование, посвященное проблеме поиска и выбора маркеров, позволяющих выявлять женщин с доброкачественными заболеваниями молочной железы, у которых может быть повышена вероятность малигнизации ТМЖ. Показатель экспрессии CD86 в сочетании с продукцией IL-18 в ТМЖ обладает определенной прогностической значимостью для оценки вероятности злокачественной трансформации при НЗМЖ [24]. При этом в ряде работ других исследователей установлено, что CD86, экспрессируемый на мембранах эпителиальных клеток, и IL-18 играют важную регулирующую роль в механизмах индукции ЭМП [25, 26]. Эти факты послужили основой для формирования концепции настоящего исследования, которая заключается в том, что сравнительное изучение закономерностей экспрессии маркеров ЭМП и ассоциированных с ним маркеров нормальных и раковых СК в ТМЖ у пациентов с НЗМЖ и инвазивной карциномой молочной железы (ИКМЖ) может способствовать разработке новых подходов для оценки риска возникновения рака молочной железы при НЗМЖ. В качестве аналитической основы для проведения такого рода исследования выбраны многомерные методы статистического анализа: канонический анализ, ROC-анализ и кластерный анализ, которые позволяют выявить скрытые закономерности исследуемых явлений и факторы, их определяющие.

Цель исследования — изучить экспрессию молекулярно-клеточных маркеров, ассоциированных с эпителиально-мезенхимальным переходом, а также с нормальными и раковыми стволовыми клетками молочной железы, в ткани молочной железы при незлокачественных заболеваниях молочной железы и инвазивной карциноме молочной железы неспецифического типа.

Материалы и методы

Материалом исследования служили биоптаты ТМЖ 53 женщин с ИКМЖ II степени злокачественности и 29 — с НЗМЖ, проходивших лечение в онкологическом отделении ГБУЗ НСО «Городская клиническая больница №1» (г. Новосибирск). Пациенты с НЗМЖ разделены на группы: женщины с фиброаденомами (ФАМ, n=13), женщины с фиброзно-кистозной мастопатией (ФКМ, n=16). Исследование одобрено этическим комитетом НИИ молекулярной биологии и биофизики ФГБНУ «Федеральный исследовательский центр фундаментальной и трансляционной медицины» Минобрнауки России, Новосибирск (протокол №2016-3 от 15.03.2016). Все процедуры, выполненные в этом исследовании, проведены в соответствии с Хельсинкской декларацией 1964 г. и последующими поправками (Brazil, Fortaleza, 2013).

Критерии исключения: признаки метастазирования в отдаленные органы и наличие сопутствующих гормональных, хронических, воспалительных и инфекционных заболеваний.

Информированное добровольное согласие на участие в исследовании и на использование образцов опухоли подписано каждым пациентом и заверено лечащим врачом.

Для проведения иммуногистохимического анализа образцы ТМЖ пациентов с ИКМЖ и НЗМЖ (8 мм³), полученные с помощью трепанобиопсии, фиксировали в нейтральном формалине, обезвоживали и заливали парафином. Парафиновые срезы депарафинизировали и регидратировали в ксилоле и этаноле по стандартной методике. В исследовании использовали антитела к следующим маркерам: CDH1 (C.n. 610181, Becton, Dickinson and Company, BD Biosciences, США), CDH2 (C.n. PAB481Hu02, Cloud-Clone Corporation, США), CD24 (C.n. 551133/HIS50, Becton, Dickinson and Company, BD Biosciences, США), CD29 (C.n. 610467, Becton, Dickinson and Company, BD Biosciences, США). Для визуализации исследуемых маркеров применяли систему визуализации VECTASTAIN ABC Kit (PK-7200, Vector Laboratories Inc., США) в соответствии с рекомендациями производителя. Срезы дополнительно окрашивали гематоксилином и эозином, после чего заключали в бальзам. Анализ препаратов проводили с помощью морфометрического комплекса на базе микроскопа Микромед 2в. 3—20 (ООО «Микромед», Россия) и цифровой CMOS-камеры Aptina MT9J003 (Aptina Imaging Corporation, США—КНР). На препаратах ТМЖ, окрашенных иммуногистохимическим методом оценивали долю клеток, экспрессирующих CDH1, CDH2, CD24 и CD29.

Статистический анализ. Для анализа различий между группами использовали непараметрический критерий Уилкоксона—Манна—Уитни. Результаты представлены в виде медианы (Me) и межквартильного размаха (Q₁—Q₃), где Q₁ — нижний квартиль, а Q₃ — верхний квартиль. Вычисления проведены с использованием программного обеспечения Statistica v. 7. ROC-анализ данных выполнен с помощью программы IBM SPSS Statistics v.22 (США). Канонический корреляционный и кластерный анализы проведены с использованием Statistica v.7 (США).

Результаты и обсуждение

В табл. 1 представлена оценка различий между образцами ТМЖ при ИКМЖ, ФКМ и ФАМ по уровню экспрессии CDH1, CDH2, CD24, CD29, а также по величине соотношения CDH1/CDH2.

Таблица 1. Экспрессия CDH1, CDH2, CD24, CD29 в образцах ткани молочной железы при инвазивной карциноме молочной железы, фиброзно-кистозной мастопатии и фиброаденоме молочной железы; соотношение CDH1/CDH2

Примечание. Данные представлены в виде Me (Q₁—Q₃). p — уровень статистической значимости при использовании критерия Манна—Уитни (между показателями у пациенток групп ИКМЖ — ФКМ, ИКМЖ — ФАМ). ИКМЖ — инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа; ФКМ — фиброзно-кистозная мастопатия; ФАМ — фиброаденома. CDH1/CDH2 — соотношение показателей экспрессии CDH1 и CDH2. p=0,000;* — p<0,0001.

Экспрессия CDH1 в образцах ИКМЖ была менее выражена, чем при ФАМ, это согласуется с концепцией о том, что при ЭМП и малигнизации ткани молочной железы происходит снижение экспрессии CDH1. Различия между группами пациентов с ИКМЖ и ФКМ по этому показателю не выявлены, что указывает на вероятность инициации процесса ЭМП при ФКМ. Поскольку, по данным литературы, экспрессия CDH2 увеличивается в процессе ЭМП, то уменьшение величины CDH1/CDH2 можно было рассматривать как дополнительный показатель малигнизации ТМЖ при ДЗМЖ. Это предположение подтвердилось. Величина CDH1/CDH2 была наименьшей в группе ИКМЖ и наибольшей при ФАМ. По величине соотношения CDH1/CDH2 группа ФКМ занимала промежуточное положение.

Канонический корреляционный анализ двух множеств переменных (CDH1; CDH2) и (CD24; CD29) показал, что между множествами существует различная степень взаимосвязи в группах ИКМЖ, ФКМ и ФАМ. Причем в группе ФАМ коэффициент канонической корреляции был наибольший (R=0,916; p=0,004), что говорит о более сильной связи между этими множествами переменных по сравнению с другими группами.

В группе ФКМ коэффициент канонической корреляции имел меньшее значение (R=0,716; p=0,048), а в группе ИКМЖ не являлся статистически значимым (R=0,357; p=0,159). Как известно, канонический анализ предназначен для анализа зависимостей между двумя множествами признаков (независимых переменных), характеризующих объекты исследования, и позволяет оценить силу и направление связи между двумя наборами переменных. Он также помогает определить, насколько сильно связаны между собой два набора переменных и какие переменные оказывают наибольшее влияние на эту связь. Полученные данные свидетельствуют о том, что сопряженность множеств показателей экспрессии (CDH1; CDH2) и (CD24; CD29), выявленная при исследовании образцов ТМЖ при ФАМ, «ослабевает» при ФКМ и полностью «исчезает» при ИКМЖ.

В табл. 2 и 3 представлены результаты ROC-анализа по выявлению различий между образцами ТМЖ при ИКМЖ, ФКМ и ФАМ по уровню экспрессии CDH1, CDH2, CD29, CD24 и соотношению CDH1/CDH2.

Таблица 2. Результаты ROC-анализа, характеризующие качество ROC-моделей при разделении всего массива параметров ткани молочной железы пациентов с инвазивной карциномой молочной железы и фиброаденомой молочной железы в зависимости от экспрессии CDH1, CDH2, CD29, CD24 и соотношения CDH1/CDH2 на две группы — ИКМЖ и ФАМ

Примечание. ФАМ — фиброаденома. Здесь и в табл. 3: ИКМЖ — инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа; ТМЖ — ткань молочной железы; CDH1/CDH2 — соотношение показателей экспрессии CDH1 и CDH2. p=0,000;* — p<0,0001.

Таблица 3. Результаты ROC-анализа, характеризующие качество ROC-моделей при разделении всего массива параметров ткани молочной железы пациентов с инвазивной карциномой молочной железы и фиброзно-кистозной мастопатией в зависимости от экспрессии CDH1, CDH2, CD29, CD24 и соотношения CDH1/CDH2 на две группы — ИКМЖ и ФКМ

Примечание. ФКМ — фиброзно-кистозная мастопатия.

Установлено, что модели с отличным качеством, характеризующие различия между образцами ИКМЖ и ФАМ, формируются по уровню экспрессии CDH2 (AUC=0,967), CD24 (AUC=1,00) и CD29 (AUC=0,965).

Различия между образцами ИКМЖ и ФКМ формируются по аналогичным параметрам: CDH2 (AUC=0,847), CD24 (AUC=0,988) и CD29 (AUC=0,662). Однако если при сравнении ИКМЖ и ФАМ качество всех моделей было отличное, то при сравнении ИКМЖ и ФКМ качество модели по экспрессии CD29 соответствовало значению «удовлетворительное», что указывало на заметное «сближение» групп ИКМЖ и ФКМ по выраженности экспрессии CD29 (см. табл. 3). При анализе CDH1/CDH2 качество модели по показателю AUC было плохое, следовательно, несмотря на то, что экспрессия CDH2 в группах с ИКМЖ и ФКМ повышается по сравнению с ФАМ, напрямую это не спряжено с высоким уровнем экспрессии CDH1 при ФАМ, который может сильно варьировать в ТМЖ как при НЗМЖ, так и при ИКМЖ (см. табл. 2, табл. 3).

Методом кластерного анализа нами проведена оценка особенностей распределения всех исследованных параметров ТМЖ из объединенной базы данных ДЗМЖ и ИКМЖ по кластерам, которые обладают схожими характеристиками (рисунок). При кластеризации объединенной базы данных пациентов с ДЗМЖ и ИКМЖ по уровню экспрессии CDH1, CDH2, CD24, CD29 и соотношению CDH1/CDH2 сформировалось три больших кластера: в кластер 1 вошли показатели пациентов с ИКМЖ (95%), ФКМ (5%), ФАМ (0%); в кластер 2 — ИКМЖ (73%), ФКМ (20%), ФАМ (7%); в 3 кластер — ИКМЖ (0%), ФКМ (29%), ФАМ (71%). В кластер 1 вошли показатели только одного пациента с ФКМ с уточнением к диагнозу — «кистозный фиброаденоматоз, крупные внутрипротоковые паппиломы».

Дендрограмма результатов иерархического кластерного анализа объединенных данных пациентов со злокачественными и незлокачественными заболеваниями молочной железы.

Дендрограмма построена по методу Уорда на основе анализа параметров: экспрессии в ткани молочной железы CDH1, CDH2, CD24, CD29; соотношения CDH1/CDH2. На горизонтальной оси — номера образцов пациентов: 1—13 — фиброаденома (ФАМ); 14—29 — фиброзно-кистозная мастопатия (ФКМ); 30—82 — инвазивная карцинома молочной железы неспецифического типа (ИКМЖ).

В подкластер 2.1 вошли параметры ТМЖ двух пациентов с пролиферативной формой ФКМ и продуктивным воспалением. В подкластер 2.2 вошли параметры ТМЖ пациентов с ФКМ, наличием атипичной гиперплазии и сопутствующим очаговым склерозирующим аденозом. Таким образом, по данным кластерного анализа к группе риска, вероятно, можно отнести пациентов с ФКМ, параметры ТМЖ которых вошли в кластер 1 и подкластер 2.1.

Как отмечено ранее, большинство раковых клеток молочной железы экспрессируют CD24 и CD29, причем для многих из них характерна их гиперэкспрессия [21, 22]. Нами получены аналогичные результаты, которые, вероятно, свидетельствуют о том, что CD24 и CD29 могут играть важную роль в поддержании внутриопухолевого микроокружения, способствующего опухолевому росту. При этом установлено, что некоторые ТМЖ от пациентов с ДЗМЖ по своему «профилю» и параметрам экспрессии CD24, CD29 и CDH2 «приближаются» к характеристикам ТМЖ при ИКМЖ. Дополнительный патогистологический анализ показал, что во всех случаях увеличение в ТМЖ при НЗМЖ содержания клеток, экспрессирующих CD24, CD29 и CDH2, ассоциировано с появлением и увеличением количества в них внутрипротоковых или внутридольковых пролифератов.

Заключение

Полученные нами результаты исследования и анализ данных научной литературы указывают на то, что определение уровней экспрессии маркеров CDH2, CD24 и CD29 в ткани молочной железы может быть полезно при формировании группы риска с повышенной вероятностью развития рака молочной железы при незлокачественных заболеваниях молочной железы.

Вклад авторов: концепция и дизайн исследования — Архипов С.А., Аутеншлюс А.И.; сбор и обработка материала — Архипов С.А., Архипова В.В., Проскура А.В., Мангазеева Е.Д.; статистический анализ данных — Архипов С.А.; написание текста — Архипов С.А., Аутеншлюс А.И.; научное редактирование — Архипов С.А., Аутеншлюс А.И.

Финансирование: осуществлялось в рамках государственного задания (№АААА-А18-118030790008-7) Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Authors contribution: study design and concept — Arkhipov S.A., Autenshlyus A.I.; data collection and processing — Arkhipov S.A., Arkhipova V.V., Proskura A.V., Mangazeeva E.D.; statistical analysis — Arkhipov S.A.; text writing — Arkhipov S.A., Autenshlyus A.I.; scientific editing — Arkhipov S.A., Autenshlyus A.I.

Financial Support: the research was carried out within the framework of the state assignment (No. AAAA-A18-118030790008-7) of the Ministry of Health of the Russian Federation.