Введение
Неослабевающий интерес современной медицинской науки к проблеме сахарного диабета (СД) обусловлен значительной распространенностью заболевания в мире, в том числе в нашей стране. Обязательным спутником СД являются сосудистые осложнения: нефропатия, ретинопатия и нейроангиопатии [1, 2]. Наиболее тяжелым осложнением признана диабетическая нефропатия. Более 30% больных СД 1-го типа с почечной патологией нуждаются в гемодиализе [2, 3]. Сведения литературы свидетельствуют о том, что маркером нефропатии являются нарушение фильтрационной способности почек и патоморфологические изменения в нефроне, приводящие к гломерулосклерозу. Однако в процессе ведения больных недостаточно учитываются данные об изменениях в канальцевом аппарате почек, тогда как они ответственны за процесс концентрирования мочи. Гипергликемия и повышенный уровень гликированного гемоглобина (HbA1c) вызывают нарушение кислородтранспортной функции крови, индуцируют образование активных форм кислорода (АФК) и процесс перекисного окисления липидов (ПОЛ). Окислительный стресс способствует ингибированию экспрессии эндотелиальной NO-синтазы (eNOS) и снижению продукции оксида азота (NO) [3, 4]. Сравнительный анализ метаболических данных с результатами функциональных показателей почек может послужить основанием для своевременной диагностики начальных этапов нефропатии, а также оптимизировать базисную терапию и профилактику. В этом плане следует отметить, что в лечении диабетической нефропатии показано применение ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (иАПФ), поскольку подавление образования ангиотензина II снижает внутриклубочковую гипертензию, препятствуя прогрессированию патологического процесса. Эталонным ингибитором АПФ (иАПФ) остается эналаприл, который появился относительно давно, но по-прежнему наиболее широко используется благодаря фармакологической эффективности, хорошей переносимости, высокой биодоступности из желудочно-кишечного тракта (60—70%) и демократичной стоимости [5, 6]. Интерес исследователей проявляется и к коэнзиму Q10 (КоQ10) — липидрастворимому антиоксиданту, который синтезируется в клетках организма и постоянно регенерирует из окисленной формы ферментными системами. Будучи компонентом дыхательной цепи, участвует в транспорте электронов, создании электрохимического градиента на внутренней мембране митохондрий для синтеза аденозинтрифосфата (АТФ). Постоянное взаимодействие КоQ10 с активными радикалами, ингибирование ПОЛ в нефроне и липопротеинах низкой плотности (ЛНП) может привести к уменьшению его содержания и необходимости пополнения экзогенно [7, 8]. Более того, данные литературы установили участие КоQ10 в передаче сигнала, участвующего в механизме секреции инсулина бета-клетками поджелудочной железы при гипергликемии [9]. В экспериментах на линейных мышах с нарушением углеводного обмена добавление в пищу КоQ10 усиливает ферментативную активность процесса синтеза инсулина и способствует снижению уровня гликемии [10]. Все указанные эффекты КоQ10 делают его привлекательным в качестве адъювантной терапии при кардио-, нефропатиях СД. Все изложенное позволило сформулировать целевую установку.
Цель исследования — изучить особенности метаболических и функциональных нарушений при диабетической нефропатии у больных СД 1-го типа и разработать способ оптимизации лечения и профилактики дальнейшего прогрессирования заболевания.
Материал и методы
Клинико-экспериментальные исследования проводили в двух вариантах — на больных СД 1-го типа и параллельно на линейных крысах с экспериментальным СД 1-го типа. Отбор больных осуществлен на базе ГБУЗ «Республиканский эндокринологический диспансер» Владикавказа, а определение функциональных и биохимических показателей выполнено в отделе патобиохимии ИБМИ ВНЦ РАН в соответствии с договором. Для проведения клинического этапа в исследование включены 49 (21 мужчина и 28 женщин) больных СД 1-го типа с длительностью заболевания от 6 до 8 лет, в возрасте 18—43 лет. Для включения больных в основную группу учитывали следующие критерии: изменение скорости клубочковой фильтрации (СКФ), наличие гипергликемии и протеинурии, повышенный уровень HbA1c, креатинина, мочевины, общего белка в сыворотке крови. Контрольную группу составили 20 человек — относительно здоровых и без СД. Базисная терапия у всех включала препараты инсулина, мембранопротектор почечного действия — Канефрон (комбинированный препарат растительного происхождения). В комплексную терапию, помимо этих препаратов, включили регулятор кровяного давления — иАПФ эналаприл и антиоксидант эндогенного происхождения КоQ10. Обследование проводили при поступлении в клинику больных СД (до лечения), а также на фоне базисной и комплексной терапии. Для оценки степени тяжести и компенсации СД 1-го типа использовали клинико-лабораторные критерии, рекомендованные ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр эндокринологии» Минздрава России: уровень гликемии, содержание HbA1c, общего белка, креатинина, мочевины в сыворотке крови, клиренс креатинина [2, 3]. Контингент обследуемых включал контрольную группу — 20 здоровых лиц без СД и манифестации другой патологии. Больные СД 1-го типа разделены на 3 группы:
1-я (n=15) — больные при поступлении до лечения;
2-я (n=15) — больные, получавшие инсулинотерапию и мембранопротектор — комбинированный препарат растительного происхождения (базисная терапия);
3-я (n=19) — больные, получавшие комплексную терапию — базисные препараты, иАПФ — эналаприл по 5 мг 1—2 раза в день и антиоксидант КоQ10 2 капсулы по 0,5 г 2 раза ежедневно в течение 21 дня во время пребывания в стационаре и в течение 3 мес амбулаторно.
По истечении сроков лечения пациенты обследованы в ГБУЗ РЭД МЗ РСО-Алания Владикавказа и в отделе патобиохимии ИБМИ ВНЦ РАН.
У представителей контрольной группы и больных СД 1-го типа кровь для анализа брали утром натощак из локтевой вены, центрифугировали при температуре 4 °C в течение 15 мин при 2 500 об/мин и получали сыворотку. В образцах сыворотки крови определяли следующие биохимические показатели: концентрацию глюкозы глюкозооксидазным методом, используя наборы GlucosoE-D (ООО «Витал Диагностикс СПБ», Россия), HbA1c — методом колориметрии, используя специальные наборы (АО «Эрба Рус», Россия), содержание общего белка, мочевины, креатинина — общепринятыми методами на автоматическом биохимическом анализаторе Vegasys («AMS s.r.l.», Италия). Для оценки интенсивности ПОЛ определяли содержание гидроперекисей (ГП) и малонового диальдегида (МДА) [11], активность каталазы методом М.А. Королюка и соавт. [12], супероксиддисмутазы (СОД) — аутоокислением адреналина [13], концентрацию суммарных метаболитов оксида азота (NOx) [14]. Для определения функционального состояния почек исследовали утреннюю мочу (с 600—900), в которой определяли концентрацию креатинина, содержание натрия, калия и белка. СКФ оценивали по клиренсу эндогенного креатинина. Определяли относительную канальцевую реабсорбцию воды, экскрецию натрия и калия с мочой, фильтрационный заряд ионов и относительную реабсорбцию натрия в почечных канальцах. Показателями нарушения функции почек были изменение СКФ мл/мин/1,73 м2, канальцевой реабсорбции воды (RH2O%) и натрия (RNa%), фильтрационного заряда натрия (FзNa) и калия (FзK) в нефроне, содержание натрия и калия в крови и моче, протеинурия и изменение содержания общего белка, креатинина и мочевины в сыворотке крови. Функциональные показатели деятельности почек рассчитывали по формулам, разработанным академиком Ю.В. Наточиным [15]. Все эти показатели определяли у здоровых лиц, у больных СД 1-го типа до лечения, на фоне базисной терапии и комплексной в стационаре и продолжали в амбулаторных условиях в течение 3 мес.
Экспериментальный СД 1-го типа моделировали на линейных крысах-самцах (Wistar, 50 голов) одной возрастной группы (10—14 мес, масса 175—230 г) введением 5% водного раствора аллоксана в дозе 10,0—15,0 мг/100 г массы тела; контролем служили здоровые животные (20 голов). В эритроцитах, гомогенатах коркового и мозгового вещества определяли концентрацию МДА и активность натрий-калиевой аденозинтрифосфатазы (Na+,K+АТФ-азы) по методу Scou в модификации Ю.В. Наточина [15, 16]. Удельную активность Na+,K+АТФ-азы рассчитывали на концентрацию белка в пробе, определяемую методом Лоури, и выражали в мкмольРн/мг белка/ч. Уровень экспрессии eNOS определяли в гомогенатах аорты на базе ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр терапии и профилактической медицины» Минздрава России. Аорты извлекали, перетирали с жидким азотом, трижды промывали фосфатным буфером pH 7,4, осадок центрифугировали (10 мин при 1000×g). Собирали в 100 мкл лизирующего буфера. Полосу, соответствующую eNOS, детектировали в соответствии с ее молекулярной массой, устанавливаемой по сравнению с белками-метчиками. Пленку высушивали на воздухе, сканировали и рассчитывали площадь под кривой с использованием программы TotalLab. Результаты представляли в условных единицах как отношение интенсивности полосы к интенсивности полосы контрольной [14].
Проведение экспериментов соответствовало этическим международным требованиям, изложенным в Хельсинкской декларации, а также стандартам гуманного отношения к животным и правилам проведения работ с использованием экспериментальных животных.
Статистическую обработку результатов проводили методом вариационной статистики с расчетом среднего арифметического, ошибки среднего (M±m) и оценкой статистической значимости данных при p<0,05 по критерию Стьюдента, оценивали корреляцию, учитывая ее статистическую значимость по таблицам (Л.С. Каминский), использовали программы Statistica 6,0 и Microsoft Excel.
Дизайн исследования представлен на рисунке.
Дизайн исследования. ЭСД — экспериментальный сахарный диабет 1-го типа.
Результаты и обсуждение
Широко используемыми показателями нефропатии являются уровень протеинурии, изменение СКФ и гистологические данные. Однако следует отметить, что для оценки функционального состояния почек представляет научный интерес изучение изменений в канальцевом аппарате нефрона [16]. В данной работе исследовали нарушение функции почек у больных СД 1-го типа, оценивая все основные процессы мочеобразования.
Анализ данных функционального состояния почек у пациентов с СД до лечения показал снижение уровня СКФ, канальцевой реабсорбции воды и наличие полиурии. Одновременно с нарушением водовыделительной функции почек имели место натрийурез вследствие более низкого уровня канальцевой реабсорбции катиона, а также снижение экскреции калия и протеинурия. Изменения электролитовыделительной функции происходили у больных СД 1-го типа на фоне сниженного уровня FзNa и FзK в нефроне. Анализ данных содержания электролитов в сыворотке крови показал снижение концентрации натрия, увеличение концентрации калия, мочевины, креатинина (табл. 1).
Таблица 1. Показатели функционального состояния почек у больных сахарным диабетом 1-го типа
| Показатели | Контрольная группа, без признаков СД (n=20) | Пациенты с СД 1-го типа | ||
| 1-я группа, до лечения (n=15) | 2-я группа, базисная терапия (n=15) | 3-я группа, комплексная терапия (n=19) | ||
| Диурез, мл/24 ч | 1380±115 | 2230±1401111 | 1870±16022 | 1360±803333 444 |
| СКФ, мл/мин/1,73 м2 | 126,4±8,56 | 76,84±8,661111 | 84,28±9,4222 | 122,8±8,6333 444 |
| RH2O, % | 99,2±0,16 | 97,59±0,361111 | 98,25±0,282222 | 99,32±0,183333 4444 |
| ENa, мкмоль/ч/100 ч | 63,4±3,6 | 98,5±2,91111 | 85,49±3,12222 | 69,5±2,753333 4444 |
| RNa, % | 98,85±0,165 | 97,5±0,181111 | 98,05±0,15222 | 98,79±0,123333 4444 |
| EK, мкмоль/ч/100 ч | 38,48±2,5 | 20,0±1,981111 | 25,05±2,052222 | 32,98±2,243333 4444 |
| Протеинурия, г/24 ч | 0,045±0,01 | 1,18±0,241111 | 0,98±0,182222 | 0,068±0,083333 4444 |
| Na+,K+АТФ-аза, мкмольРн/мг белка/ч | 4,39±0,18 | 3,18±0,221111 | — | 3,818±0,13433 4444 |
Примечание. Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего M±m. 1 — статистическая значимость различий по сравнению с показателями контрольной группы; 2 — статистическая значимость различий по сравнению с показателями до лечения сахарного диабета; 3 — статистическая значимость различий по сравнению с показателями при базисной терапии сахарного диабета; 4 — статистическая значимость различий между показателями при комплексной и базисной терапии сахарного диабета.
1111 — p<0,001; 111 — p<0,01; 11 — p<0,02; 1 — p<0,05.
Для выяснения механизма сниженной реабсорбции натрия в канальцах почек у больных СД 1-го типа в экспериментальных исследованиях мы определяли содержание МДА и активность фермента Na+,K+АТФ-азы в клетках коркового и мозгового вещества почечной ткани. Результаты показали статистически значимое повышение содержания МДА (р<0,001) и более низкий уровень активности энзима в корковом и мозговом веществе почечной ткани. Эти данные активности энзима Na+,K+АТФ-азы мы использовали для выяснения причины натрийуреза и сниженной канальцевой реабсорбции натрия у больных СД 1-го типа (см. табл. 1).
Логика использования экспериментальных данных обоснована необходимостью выяснения сходства и различий в нарушениях уровня канальцевой реабсорбции натрия у больных СД 1-го типа и активности Na+,K+АТФ-азы почечной ткани при СД 1-го типа в эксперименте. Повреждающее действие на функцию почек в клинических и экспериментальных условиях оказали стойкая гипергликемия и высокий уровень HbA1c, способствующие развитию гемической гипоксии. Инициировалось образование АФК, индуцирующие процесс ПОЛ, о чем свидетельствовали данные повышения концентрации ГП и МДА в эритроцитах. Анализ данных активности антиоксидантной системы (АОС) показал ингибирование СОД, тогда как активность каталазы повышалась.
У больных СД 1-го типа на фоне окислительного стресса выявлено также снижение концентрации оксидов азота (NOx), уровень которых находится в отрицательной корреляционной связи с содержанием МДА (r= –0,74, р<0,001). Нужно полагать, что АФК и интенсивность ПОЛ способствовали снижению уровня экспрессии eNOS и продукции NOx, что и показано в исследовании (табл. 2). Это положение согласуется с нашими результатами, полученными ранее, и данными других исследователей [4, 17].
Таблица 2. Изменение биохимических показателей при диабетической нефропатии у больных сахарным диабетом 1-го типа
| Показатели | Контрольная группа, без признаков СД (n=20) | Пациенты с СД 1-го типа | ||
| 1-я группа, до лечения (n=15) | 2-я группа, базисная терапия (n=15) | 3-я группа, комплексная терапия (n=19) | ||
| Глюкоза, ммоль/л | 5,06±0,1 | 14,6±0,5аааабббб | 10,6±0,2аааабббб | 7,133±0,261аааавввв |
| HbA1с, % | 5,3±0,81 | 10,4±0,71аааа | 8,6±0,71ааааб | 5,3±0,81ввв |
| ГП, ммоль/л | 0,97±0,09 | 1,30±0,29 | 1,04±0,2 | 0,95±0,16 |
| МДА, нмоль/мл | 2,93±0,177 | 5,70±0,80ааа | 4,20±0,61а | 3,80±0,32ааб |
| СОД, ед/мг белка | 3,55±0,156 | 2,45±0,061ааа | 2,65±0,045ббб | 3,15±0,035вввв |
| Каталаза, мкат/л | 251,1±42,8 | 564,8±43,2аааа | 438,0±34,4бб | 329±23,7ввв |
| NO, мкмоль | 53,64±0,831 | 34,5±1,208аааа | 41,9±0,459аааабббб | 50,05±1,39ббббвввв |
Примечание. Данные представлены в виде среднего и ошибки среднего M±m. а — статистическая значимость различий по сравнению с показателями контрольной группы; б — статистическая значимость различий по сравнению с показателями до лечения сахарного диабета; в — статистическая значимость различий по сравнению с показателями при базисной терапии сахарного диабета. аааа — p<0,001; ааа — p<0,01; аа — p<0,02; а — p<0,05. ГП — гидроперекись; МДА — малоновый диальдегид; СОД — супероксиддисмутаза; NO — оксид азота.
Выявленные изменения свободнорадикальных реакций и недостаток NOx сопровождались нарушением микроциркуляторной гемодинамики в нефроне, повышением проницаемости фильтрующей и базолатеральной мембраны канальцев почек, о чем свидетельствовали данные протеинурии, натрийуреза и полиурии у больных СД 1-го типа (см. табл. 1, 2).
На фоне базисной терапии у больных СД 1-го типа имела место положительная динамика со стороны функционального состояния почек сравнительно с исходными данными при поступлении в клинику. Однако эти результаты характеризовались довольно значительным отставанием показателей от уровня у пациентов контрольной группы. Сохранились выраженная полиурия, протеинурия, натрийурез и относительно невысокие показатели СКФ, канальцевой реабсорбции воды и натрия. Метаболические показатели характеризовались гипергликемией, повышенным уровнем HbA1c, наличием окислительного стресса и сниженным уровнем NOx.
В настоящее время в литературе широко обсуждаются вопросы оптимизации лечения и профилактики сосудистых осложнений при СД [18]. Анализ данных отечественной и иностранной литературы в этом аспекте позволил нам остановиться на комплексной терапии, включающей наряду с инсулинотерапией, мембранопротектором — комбинированным препаратом растительного происхождения, ингибитор АПФ (эналаприл) и антиоксидант КоQ10 [7—9]. Убихинон композитум (КоQ10) участвует в электронтранспортной дыхательной цепи, способствует синтезу АТФ, нейтрализует АФК и оказывает антиоксидантное действие, защищая фосфолипиды клеточных мембран от перекисной модификации. Более того, имеются данные об участии КоQ10 в передаче сигнала, увеличивающего секрецию инсулина при повышении уровня глюкозы в крови [10].
Комплексное лечение, включающее препараты базисной терапии, иАПФ (эналаприл) и антиоксидант (КоQ10), обусловило более выраженное снижение в крови уровня конечного продукта ПОЛ — МДА. Активность АОС — СОД нарастала и статистически значимо повысилась по сравнению с исходными данными базисного лечения (см. табл. 2). Повышение антиоксидантного статуса и ингибирование ПОЛ при комплексной терапии с КоQ10 и эналаприлом привело к увеличению содержания NOx, лучшей вазодилатации микроциркуляторных сосудов, почек. Позитивная динамика содержания основного вазодилататора — NOx и функционального состояния почек у больных СД 1-го типа обусловлена, вероятно, такими же процессами, как в эксперименте. Так, в экспериментальных исследованиях показано повышение уровня экспрессии eNOS в эндотелии аорты в 4 раза (с 0,305±0,003 ед. до 1,55±0,029 ед.) на фоне комплексной терапии с КоQ10. Изменения основных процессов мочеобразования у больных СД 1-го типа характеризовались статистически значимым повышением уровня СКФ, канальцевой реабсорбции воды и натрия, сокращением величины суточного диуреза, протеинурии, экскреции ионов натрия, калия (см. табл. 1). Экспериментально установлено, что причиной натрийуреза является сниженная активность Na+,K+АТФ-азы почечной ткани. Эти результаты согласуются с данными литературы [16, 19]. Комплексная терапия у больных СД 1-го типа также привела к статистически значимому снижению уровня гликемии, HbA1c в крови, концентрации мочевины и креатинина, тогда как содержание общего белка и NOx в сыворотке крови повысилось (см. табл. 2).
Исходя из полученных результатов, следует отметить, что для оценки функционального состояния почек использованы данные об изменениях СКФ и в канальцевом аппарате нефрона [16]. Проведен сопоставительный анализ изменений метаболических и функциональных данных в динамике лечения. Такой комплексный подход позволил оптимизировать лечение и профилактику прогрессирования нарушений функции почек. Логическая связь проведения параллельно клинических и экспериментальных исследований заключалась в том, чтобы экспериментальным путем изучить патогенетические звенья метаболических и функциональных нарушений, которые могут наблюдаться у больных СД 1-го типа.
Таким образом, полученные данные патогенеза диабетической нефропатии позволили разработать и использовать возможности для оптимизации лечения и профилактики дальнейшего прогрессирования патологического процесса. Целесообразность комплексной терапии подтверждена доказательной базой данных, свидетельствующих о ее позитивном влиянии на показатели окислительно-восстановительных реакций, продукцию NOx, водо- и электролитовыделительную функции почек при СД 1-го типа и о возможностях использования для профилактики дальнейшего прогрессирования нарушений функции почек.
Заключение
Анализ результатов исследования показал, что в формировании нефропатии и повреждении структур нефрона у пациентов с СД 1-го типа существенную роль играют изменения биохимических систем: гипергликемия, уровень гликированного гемоглобина, процесс перекисного окисления липидов, угнетение активности антиоксидантной системы, снижение содержания оксидов азота, дисфункция эндотелия сосудов, приводящая к нарушению микроциркуляторной гемодинамики, — эти данные подтверждены экспериментальным путем. Метаболические проявления явились патогенетической основой нарушения функционального состояния почек. Совокупность этих изменений позволила разработать комплексный подход для коррекции выявленных нарушений: сочетание препаратов базисной терапии с регулятором микроциркуляторной гемодинамики — иАПФ и антиоксидантом коэнзимом Q10. Такая тактика лечения обеспечила повышение антиоксидантного статуса, ингибирование свободнорадикального окисления, увеличение содержания оксидов азота вследствие повышения уровня экспрессии эндотелиальной синтазы оксида азота. Метаболические изменения сопровождались повышением функционального резерва почек: скорости клубочковой фильтрации, канальцевой реабсорбции воды и натрия, сокращением величины диуреза, протеинурии, экскреции ионов натрия и калия. Таким образом, подтверждена целесообразность и эффективность использования комплексной терапии в лечении диабетической нефропатии.
Участие авторов: концепция и дизайн исследования — С.Г. Дзугкоев, Ф.С. Дзугкоева; сбор и обработка материала — С.Г. Дзугкоев; статистический анализ данных — С.Г. Дзугкоев; написание текста — С.Г. Дзугкоев, Ф.С. Дзугкоева; редактирование — Ф.С. Дзугкоева.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.