Введение
Спаечный процесс органов малого таза является одной из важнейших нерешенных проблем оперативной гинекологии [1, 2]. Известно, что брюшина обладает способностью реагировать на любые раздражители — механические, термические или другие — путем образования спаек, биологический смысл которых — ограничить место воздействия, препятствуя распространению патологического процесса по брюшной полости. Но результатом этого «защитного» механизма зачастую становятся трубно-перитонеальное бесплодие, хроническая тазовая боль, нарушение анатомо-топографического расположения органов малого таза с нарушением их архитектоники и функциональной активности [3]. При этом консервативные методы лечения спаечной болезни не имеют должной эффективности, а хирургическое лечение зачастую приводит к усугублению образования спаек [1, 4].
Роль развития послеоперационных спаек как важной причины заболеваемости отмечена в литературе в 1987 г. M.P. Diamond и соавт. [5, 6]. В 1996 г. в журнале «Fertility and Sterility» опубликованы результаты слепого проспективного рандомизированного мультицентрового исследования, включавшего 127 пациенток, которым вводили противоспаечный барьер после миомэктомии и выполняли релапароскопию для оценки послеоперационных спаек. Использование авторами противоспаечного геля привело к значительному снижению частоты, площади и выраженности адгезивных участков на передней и задней поверхности матки. У пациенток после применения противоспаечного геля также наблюдалось статистически значимо меньшее количество спаек по задней поверхности матки, чем у пациенток без применения данного препарата. Эти положительные эффекты достигнуты одновременно с отсутствием побочных явлений или повышенного риска осложнений [7, 8]. Тем не менее морфологическая характеристика спаек и механизм действия противоспаечных барьеров недостаточно изучены.
Рядом исследований показана противоспаечная активность гиалуроновой кислоты. В рандомизированном клиническом исследовании P.R. Koninckx и соавт. при добавлении гиалуронового барьера спайки уменьшались более чем на 95% [9]. Эффективность и безопасность применения гелей на основе гиалуроновой кислоты оценивалась в более современных слепых проспективных рандомизированных исследованиях [10]. Кроме того, в литературе мы не обнаружили исследований, посвященных ультрастуктурным изменениям, возникающим при применении препаратов, содержащих гиалуроновую кислоту.
В связи с этим представляется целесообразным изучение возможности применения препарата на основе гиалуроновой кислоты Антиадгезин гель противоспаечный рассасывающийся стерильный (далее — гель Антиадгезин) для предотвращения образования послеоперационных спаек в малом тазу в модельном эксперименте.
Цель исследования — изучить в эксперименте и оценить эффективность применения противоспаечного геля Антиадгезин на основе гиалуроновой кислоты для предотвращения образования спаек в послеоперационном периоде.
Материал и методы
Для моделирования спаечного процесса в малом тазу в эксперименте использованы 11 самок крыс Вистар (полученных из питомника ФМБА «Столбовая»), распределенных в 2 группы: контрольную (n=5 крыс) и экспериментальную (n=6). Животных содержали в стандартных условиях температурного режима и естественного освещения при свободном доступе к корму и воде. Все животные получали стандартный корм БК-120 (ООО «Лабораторкорм», Россия). Продолжительность эксперимента составила 14 суток. На проведение исследования получено разрешение биоэтического комитета ФГБНУ НИИМЧ им. А.П. Авцына, протокол №35(10) от 14.04.21.
Методика операции. Операция проведена согласно модели, предложенной О.А. Мынбаевым и соавт. [1, 2]. Подготовительные мероприятия для проведения оперативного вмешательства выполняли с соблюдением стандартных правил асептики и антисептики. Доступ осуществляли через лапаротомный разрез по средней линии живота с послойным рассечением слоев брюшины острым способом. Для моделирования гинекологической операции использовали одноразовые щеточки для проведения цитологического соскоба, которыми травмировали поверхность рогов матки с двух сторон. Далее 6 особям из экспериментальной группы внутрибрюшинно вводили 0,5 мг препарата Антиадгезин гель противоспаечный рассасывающийся стерильный («Stada Arzneimittel AG», Германия). Животным контрольной группы проведено аналогичное оперативное вмешательство без последующего применения исследуемого препарата. Ушивание брюшины в области операционной раны проводили с помощью рассасывающей нити ПГА 3/0 (ООО «Линтекс», Россия). При ушивании кожи применяли нерассасывающие шелковые нити 3/0 (ООО «Линтекс», Россия).
Ежедневно осуществляли осмотр животных, а также оценивали общее состояние животного и хирургической раны. Гибели животных в послеоперационном периоде и на протяжении всего эксперимента не было.
Выведение из эксперимента. Выведение из эксперимента осуществляли путем передозировки эфирного наркоза на 14-е сутки после операции. Вскрытие брюшной полости проводили перпендикулярно средней линии живота, вдоль ребер (модификация верхнего поперечного доступа по Шпренгелю), затем разрез проходил вдоль боковой линии слева и справа для лучшей визуализации. Лоскут кожи с брюшиной оттягивали с небольшим натяжением постепенно сверху вниз для оценки выраженности спаечного процесса между брюшиной и внутренними органами.
Образованные спайки с тканью органа от каждого наблюдения вырезали ножницами и укладывали в кассеты для дальнейшей фиксации в 10%-м забуференном растворе нейтрального формалина (для проведения гистологического и гистохимического исследования).
После фиксации материала в 10% забуференном растворе нейтрального формалина в течение 48 ч проводилась гистологическая проводка по стандартной методике в гистопроцессоре Leica ASP 30 («Leica Biosystems Nussloch GmbH», Германия), после чего осуществлялась заливка материала в парафиновые блоки на станции Leica EG 1150 («Leica Biosystems Nussloch GmbH», Германия). Далее изготавливали не менее 12 гистологических срезов толщиной 3—4 мкм. В автоматической станции Leica ST 5010 («Leica Biosystems Nussloch GmbH», Германия) полученные срезы окрашивали гематоксилином и эозином и гистохимическим методом по Маллори для выявления коллагеновых волокон. При оценке гистохимической реакции по Маллори учитывались следующие изменения:
— ядра, мышечные волокна, волокна нейроглии, хрящ, кость — красное окрашивание;
— коллагеновые волокна — темно-синие окрашивание;
— эритроциты, миелин — насыщенно-желтое окрашивание;
— эластические волокна бледно-розовое окрашивание, желтое или не окрашиваются.
Исследование микропрепаратов проводили с помощью микроскопа биологического Leica DM 2500 («LeicaMicrosystems CMS GmbH», Германия) с цифровой фотокамерой с последующей фотофиксацией и анализом изображений в программном обеспечении Image Scope M. Проводили сравнительную оценку патоморфологических изменений в органах и тканях в условиях экспериментальной модели спаечного процесса по сравнению с группой контроля, наличия воспалительной реакции, реакции мезотелия, наличия жировой ткани. Определяли количество фибробластов, плотность расположения коллагеновых/эластических волокон, наличие кровеносных сосудов и их полнокровие.
Для проведения исследования методами трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ) образцы перитонеальных спаек размером 2 мм3 фиксировали раствором глутарового альдегида 2,5% на фосфатном буфере (pH 7,4), дофиксировали в растворе четырехокиси осмия (OsO4) 1%, обезвоживали в этаноле по общепринятой схеме, в процессе обезвоживания контрастировали 1% уранилацетатом на этаноле 70% и проводили заливку в смесь эпон-аралдит по стандартной методике.
Ультратонкие срезы получали на ультратоме LKB-III («LKB Produkter AB», Швеция), срезы дополнительно контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу и просматривали в просвечивающем электронном микроскопе JEM-100CX («JEOL», Япония). Фотофиксация препаратов осуществлялась с помощью камеры Gatan ES500W Erlangshen (Model 782), («Gatan Inc.», США).
В ходе проведения трансмиссионной электронной микроскопии оценивали морфологическую картину ткани спаек, выраженность и характер васкуляризации, интенсивность разрастания коллагеновых волокон.
Микроморфометрически определяли толщину спаек, коллагеновых пучков в каждом образце, также вычисляли отношение эластических волокон к коллагеновым. Для этого определяли площадь, занимаемую каждым типом волокон на площади 100 мкм2.
Статистическую обработку результатов выполняли в программе GraphPad Prism v8.41 («GraphPad Software Inc.», США). Для выявления нормальности распределения использовали тест Д’Агостино—Пирсона. При нормальном распределении использовали t-тест Стьюдента для парного сравнения, при ненормальном распределении — тест Манна—Уитни для парного сравнения. Статистически значимыми считали различия при уровне статистической значимости (α) или вероятности ошибки отклонения от нулевой гипотезы или ниже 5% (p<0,05). Цифровые данные отображены в формате M±m, где M — среднее арифметическое, а m — стандартная ошибка среднего арифметического.
Результаты
При осмотре органов брюшной полости в 36% наблюдений (n=4) у животных обеих групп в равных пропорциях отмечалось повышенное содержание жировой ткани и увеличенный за счет этого большой сальник.
При вскрытии брюшной полости у животных контрольной группы нами обнаружено наличие плотных тяжей спаек между большим сальником и областью разреза брюшины, а также в зонах повреждения серозного слоя рогов матки толщиной от 0,5 до 1,5 мм, а в 40% наблюдений визуально определялись в толще кровеносные сосуды. Выявленные спайки были плотно сращены с зоной прикрепления и не отделялись при натяжении кожного лоскута. В малом тазу между участками рога матки, подвергнутыми механической травматизации, и петлями тонкой и толстой кишок имелись тонкие тяжи соединительнотканных спаек, отделяющихся при натяжении с небольшим усилием, и в 40% с наличием тонких кровеносных сосудов (рис. 1 на цв. вклейке).
Рис. 1. Макроскопическая картина при вскрытии брюшной полости.
а — экспериментальная группа; б, в — контрольная группа.
При исследовании брюшной полости крыс из экспериментальной группы в 100% наблюдений отмечено отсутствие спаечного процесса и полная регенерация области операционной раны со стороны париетальной брюшины. В 50% наблюдений между поврежденным серозным слоем рога матки и большим сальником определялись единичные нежные, тонкие пленчатые и нитевидные спайки, легко отделяющиеся при натяжении. В 16,6% (1 наблюдение) обнаружена спайка между париетальной брюшиной в области малого таза и большим сальником, которая была представлена более плотным тяжом толщиной 1 мм, однако при натяжении с приложением небольшого усилия легко отделилась.
При микроскопическом исследовании материала животных контрольной группы в 100% наблюдений отмечались плотные пучки из дезориентированных волокон и пленок, преимущественно представленных коллагеновыми волокнами с наличием фибробластов и сосудов капиллярного типа. Наблюдалось утолщение слоя мезотелия за счет пролиферативной активности в зоне повреждения. В 80% наблюдений присутствовала жировая ткань в спайке. В области прикрепления спайки к брюшной стенке определяется грубоволокнистая соединительная ткань, плотно примыкающая к брюшине и мышечной ткани (рис. 2 на цв. вклейке), в этой зоне воспалительная реакция не выявлена, встречаются единичные сегментоядерные лейкоциты и лимфоциты. Коллагеновые волокна при окраске по Маллори приобретали темно-синий цвет за счет расположения плотными островками и тяжами. В средней части визуализируются сформированные артериальные сосуды (рис. 3 на цв. вклейке). В 60% наблюдений определялась созревающая грануляционная ткань с большим числом фибробластов и сосудов капиллярного типа (см. рис. 3, а), при этом расположение коллагеновых волокон также было плотным (см. рис. 3, б).
Рис. 2. Контрольная группа. Микрофотографии места прикрепления спайки к брюшной стенке.
Наличие плотных пучков коллагеновых волокон, врастающих в мышечную ткань. а — окраска гематоксилином и эозином, ×100;б, в — окраска по Маллори, ×100.
Рис. 3. Контрольная группа. Морфологическая картина спайки.
Наличие созревающей грануляционной ткани, фибробластов и большого числа коллагеновых волокон. а — окраска гематоксилином и эозином, ×100; б, в — окраска по Маллори, ×200.
При электронно-микроскопическом исследовании также установлено, что у животных, подвергавшихся оперативному вмешательству без последующего применения геля Антиадгезин (контрольная группа), перитонеальные спайки характеризуются выраженной фибротизацией (рис. 4). В толще спайки наблюдается значительное количество зрелых коллагеновых волокон, образующих толстые организованные пучки, преимущественно ориентированные параллельно друг другу, реже — дезорганизованные (см. рис. 4, а, б, г). Толщина спаек у животных этой группы равна 1,23±0,16 мм. Средняя толщина коллагеновых волокон составляет 7,60±0,81 мкм. Количество эластических волокон значительно меньше. Соотношение эластических волокон к коллагеновым равно 1:11,8. Доля, занимаемая эластическими волокнами равна 8,47±1,11%, коллагеновыми — 91,53±6,17%. Для образцов характерно выраженное разрастание кровеносных сосудов микроциркуляторного русла с преобладанием артериол (см. рис. 4, в). Выявлено присутствие значительного числа активных фибробластов (см. рис. 4, д).
Рис. 4. Контрольная группа. Ультраструктура перитонеальных спаек животных, подвергавшихся хирургическому вмешательству без последующего применения противоспаечного геля.
В толще спаек определяется большое количество коллагеновых волокон с образованием пучков, большое количество кровеносных сосудов по типу капилляров. Трансмиссионная электронная микроскопия, а, б — ×8000, в — ×10 000, г, д —×14 000.
Для морфологического исследования были взяты все найденные спайки от 50% крыс экспериментальной группы, во второй половине спайки обнаружены не были. В отличие от контрольной группы у животных экспериментальной группы немногочисленные спайки были представлены нежными пленками и нитями (рис. 5, а на цв. вклейке), состоящими как из эластических волокон (розовое окрашивание) (рис. 5, б), так и разрыхленных неплотных молодых коллагеновых волокон (голубое окрашивание). Мезотелий представлен одно- и двурядным слоем клеток. Кровеносная сеть была в виде единичных капилляров. Очагов грануляционной ткани выявлено не было.
Рис. 5. Экспериментальная группа. Микрофотографии пленчатых спаек.
Тонкие пленки ткани, состоящие преимущественно из эластических (розовый цвет) и немногочисленных формирующихся коллагеновых волокон (голубой цвет). а — окраска гематоксилином и эозином, × 200; б — окраска по Маллори, × 200.
В экспериментальной группе животных, у которых применен гель Антиадгезин, перитонеальные спайки (рис. 6) представлены рыхлой волокнистой соединительной тканью с невысокой и равномерной васкуляризацией капиллярного типа и небольшим количеством активных фибробластов (см. рис. 6, а). Спайки у животных этой группы более тонкие, чем в контроле — 0,84±0,11 мм (рис. 7). Отмечается количественное преобладание эластических волокон, суммарное накопление коллагеновых волокон в ткани перитонеальных спаек у животных данной группы невелико, соотношение эластических волокон к коллагеновым существенно отличается от показателей животных контрольной группы, составляя 3,11:1. Доля, занимаемая эластическими волокнами, составляет 67,89±4,21%, коллагеновыми — 32,15±6,17% (рис. 8). Коллагеновый компонент спаек представлен незрелыми волокнами, характеризующимися малой толщиной и неупорядоченной архитектоникой (см. рис. 6, б), средней толщиной 1,50±0,25 мкм. Наблюдается умеренно выраженное присутствие полиморфноядерного лейкоцитарного инфильтрата, локализованного преимущественно периваскулярно (см. рис. 6, в).
Рис. 6. Экспериментальная группа. Ультраструктура перитонеальных спаек животных после хирургического вмешательства и применения геля Антиадгезин.
Трансмиссионная электронная микроскопия, а, б — ×6700, в — ×8000.
Рис. 7. Толщина перитонеальных спаек и содержащихся в них коллагеновых волокон у крыс.
* — p≤0,05; ** — p≤0,0005 по сравнению с показателями животных контрольной группы.
Рис. 8. Соотношение площади, занимаемой коллагеновыми и эластическими волокнами на срезах в перитонеальных спаек крыс, %.
а — контрольная группа; б — экспериментальная группа.
Обсуждение
Спайки брюшины после хирургического вмешательства остаются сложной проблемой, приводящей к хронической тазовой боли, бесплодию и иногда к кишечной непроходимости. Серия экспериментов R. Corona и соавт. на лапароскопической мышиной модели указывает на острое воспаление всей брюшной полости как на движущий механизм спайкообразования [8].
Традиционно образование спаек рассматривают как локальный ответ, происходящий вследствие воздействия на брюшину, вовлекающий перитонеальную поверхность, мезотелиальные клетки, базальную мембрану, субэндотелиальную соединительную ткань [9—11]. Эти процессы вызывают каскад событий, которые при сбалансированных механизмах заживления приводят к восстановлению брюшины, а при нарушении баланса к формированию спаек [12—16]. Повреждение брюшины может происходить различными путями. Описано хирургическое воздействие: денудация (высушивание), сдавление тканей, длительность и травматичность операции, чрезмерная коагуляция тканей; использование агрессивных хирургических энергий, попадание инородных тел в рану, наложение швов (кетгутовых, хромированных), натяжение брюшины, сгустки крови, использование грубых инструментов [17—22].
Использование барьеров для предотвращения образования спаек основано на господствующей концепции, согласно которой заживление брюшины и образование спаек происходит в течение нескольких дней и является результатом местного воспалительного процесса. В этом процессе большую роль играют отложение фибрина и фибринолиз [23—25].
Полученные нами результаты относительно влияния адгезина на ультраструктуру и количественные характеристики спаек являются абсолютно новыми и рождают ряд вопросов для дальнейшего изучения.
В частности, хорошо известно, что гиалурноновая кислота, входящая в состав геля Антиадгезин, является активатором фибробластов и синтеза коллагена, чего мы не обнаружили [26].
Однако наблюдаемый нами эффект может быть обусловлен физико-химическими свойствами геля Антиадгезин, противоспаечный эффект которого обусловлен тем, что после аппликации его в области операционного поля гель прочно скрепляется с поверхностью, не растекаясь к анатомическим поверхностям и образует вязкое смазывающее покрытие, которое обеспечивает скольжение соседних поврежденных участков и предупреждает их слипание. Гель Антиадгезин, являясь биодеградируемым покрытием, разделяющим соприкасающиеся поверхности только на период критической фазы раневого заживления и послеоперационного спайкообразования, продолжающийся в течение недели, не влияет на нормально протекающие процессы регенерации [27—31].
Заключение
Результаты морфологического и ультраструктурного исследования свидетельствуют о том, что применение препарата Антиадгезин гель противоспаечный рассасывающийся стерильный вызывает статистически значимое уменьшение толщины послеоперационных перитонеальных спаек у крыс, существенное снижение доли содержащегося в них коллагена при его неупорядоченном расположении и снижении толщины его волокон. У животных экспериментальной группы обнаружено уменьшение интенсивности воспалительного процесса, усиление регенерации ткани в области повреждения без активации пролиферативных процессов, таким образом предотвращается формирование коллагеновых спаек. При электронно-микроскопическом исследовании также установлено, что у животных, подвергавшихся оперативному вмешательству без последующего применения противоспаечного геля (контрольная группа), перитонеальные спайки характеризуются выраженной фибротизацией. В толще спайки наблюдается значительное количество зрелых коллагеновых волокон, образующих толстые организованные пучки. У животных экспериментальной группы после применения противоспаечного геля при патоморфологическом исследовании обнаружено, что перитонеальные спайки представлены рыхлой волокнистой соединительной тканью с невысокой и равномерной васкуляризацией капиллярного типа и небольшим количеством активных фибробластов.
Данные литературы и собственные результаты позволяют нам предположить целесообразность дальнейшего комплексного исследования механизмов противоспаечной активности гелей на основе гиалуроновой кислоты.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.