Введение
Бесплодие неясного генеза остается одной из нерешенных проблем в области репродуктивной медицины, в связи с чем ведутся исследования, направленные на снижение доли идиопатического фактора бесплодия путем выявления репродуктивно значимой соматической патологии. В частности, имеются сообщения об оценке влияния антитиреоидных аутоантител на результаты программ лечения бесплодия методами вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) у женщин с аутоиммунным тиреодитом в состоянии эутиреоза [1, 2]. В этом вопросе консенсус еще предстоит найти: некоторые исследователи демонстрируют строгую сопряженность между наличием антитиреоидных аутоантител и неудачами программ ВРТ [1—3], тогда как другие — опровергают данное предположение [4, 5].
Данное исследование направлено на изучение особенностей влияния антител к тиреоидной пероксидазе (АТ-ТПО) и антител к тиреоглобулину (АТ-ТГ) на различные этапы проведения программ по лечению бесплодия. Выполнен анализ возможного прямого воздействия аутоантител к антигенам щитовидной железы на параметры фолликулогенеза и эмбриологического этапа программ ВРТ у женщин с аутоиммунным тиреодитом и нормальными показателями функции щитовидной железы.
Цель исследования — изучить особенности и результативность программ лечения бесплодия методами ВРТ у женщин с подтвержденным диагнозом аутоиммунного тиреоидита и наличием аутоантител к ткани щитовидной железы.
Материал и методы
Дизайн исследования — проспективное когортное сравнительное исследование.
Исследование проведено в отделении вспомогательных репродуктивных технологий (руководитель — проф. А.М. Гзгзян) ФГБНУ «НИИ АГИР им. Д.О. Отта» в период с 2018 по 2020 г.
В общей сложности исследование включило результаты 139 протоколов экстракорпорального оплодотворения и экстракорпорального оплодотворения с использованием методики инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки (ЭКО/ЭКО-ИКСИ). Критерии включения в исследование: возраст 20—40 лет; наличие бесплодия, для лечения которого необходимо применение ЭКО/ЭКО-ИКСИ; уровень антимюллерова гормона >1,0 нг/мл, уровень тиреотропного гормона <2,5 мМЕ/л. Критерии исключения: индекс массы тела >35 кг/м2, наличие сахарного диабета 1-го типа и/или прочих заболеваний эндокринной системы (помимо аутоиммунного тиреоидита), предшествующие оперативные вмешательства на щитовидной железе и яичниках, наличие противопоказаний для проведения ЭКО согласно приказу Минздрава России от 30.08.12 №107н (ред. от 11.06.15 и от 01.02.18) «О порядке использования вспомогательных репродуктивных технологий, противопоказаниях и ограничениях к их применению». В основную группу включены 40 женщин с диагнозом: бесплодие без нарушения функции щитовидной железы с диагностическими титрами аутоантител в крови АТ-ТПО и/или АТ-ТГ (30 МЕ/мл и выше). Группу сравнения составили 99 женщин с диагнозом: бесплодие без антител к ткани щитовидной железы. На этапе подготовки к лечению бесплодия методами ВРТ всем пациенткам, включенным в исследование, проведено стандартное клинико-лабораторное обследование.
Во всех случаях стимуляция суперовуляции в программе ЭКО проводилась в «гибком» протоколе с применением антагонистов гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ).
Об эффективности стимуляции яичников судили по суммарной, средней ежедневной и эффективной дозе гонадотропинов, количеству дней стимуляции и количеству полученных ооцитов в день трансвагинальной пункции.
Эмбрионами оптимального качества на 3-й день культивирования считали 8-клеточный эмбрион с фрагментацией менее 10%. Эмбрионами оптимального качества на 4-е сутки культивирования считались морулы Grade 3 и 4 [6]; на 5-е сутки — бластоцисты 3ВВ и более [7]. Перенос не более двух эмбрионов в полость матки проводился на 3—5-е сутки культивирования. Оставшиеся жизнеспособные эмбрионы подвергались витрификации.
С целью поддержки лютеиновой фазы менструального цикла во всех случаях использованы препараты микронизированного прогестерона.
С целью диагностики беременности определяли уровень хорионического гонадотропина человека-β (β-ХГЧ) на 14-й день после переноса эмбрионов. На 21—25-й день после переноса эмбрионов проводили ультразвуковое исследование органов малого таза.
Статистический анализ проводили с применением стандартных методов описательной статистики с использованием пакета прикладных программ Stata Software, версия 14 («Stata Corp.», College Stasion, США) MacOS. Гипотезу на «нормальность» распределения признака в каждой группе проверяли с использованием критерия Колмогорова—Смирнова с поправкой Лиллиефорса. Методы непараметрической статистики (U-критерий Манна—Уитни, критерий χ2 Пирсона) применяли для расчета качественных порядковых и количественных признаков с ненормальным распределением. При нормальном распределении данные описывали с применением средней арифметической и стандартного отклонения (M±SD); при отклонении распределения от нормального определяли медиану (Me), минимальное (LQ) и максимальное (UQ) значения. Различия считали статистически значимыми при уровне значимости p<0,05. Корреляционный анализ проводили с использованием коэффициента корреляции Пирсона (Rs).
Результаты
Результаты клинико-анамнестического обследования женщин обеих групп не выявили статистически значимых различий (табл. 1).
Таблица 1. Сравнительная характеристика клинико-анамнестических данных обследованных женщин
Table 1. Characteristics of clinical and anamnestic data of the groups studied
| Параметр | Основная группа (n=40) | Группа сравнения (n=99) | (*) p-value | ||||
| LQ | Me | UQ | LQ | Me | UQ | ||
| Возраст, годы | 32 | 35,5 | 37 | 30 | 33 | 36 | 0,075 |
| ИМТ, кг/м2 | 21 | 23 | 27 | 21 | 23 | 27 | 0,56 |
| Возраст менархе, годы | 12 | 13 | 14 | 12 | 13 | 14 | 0,409 |
| Длительность бесплодия годы | 3 | 4 | 5 | 3 | 5 | 7 | 0,177 |
| ЭКО в анамнезе | 0 | 1 | 2 | 1 | 1 | 2 | 0,0004 |
Примечание. LQ — нижний квартиль; Me — медиана; UQ — верхний квартиль; ИМТ — индекс массы тела; ЭКО — экстракорпоральное оплодотворение. (*) — U-критерий Манна—Уитни; различия в группах статистически значимые при уровне p<0,05.
Средний возраст обследованных сопоставим в исследуемых группах и, как правило, превышал 32 года. Длительность бесплодия колебалась от 2 до 8 лет. Лечение бесплодия методами ВРТ в анамнезе статистически значимо чаще встречалось у женщин группы сравнения.
Анализ показателей паритета выявил статистически значимое большее количество беременностей у женщин основной группы по сравнению с группой сравнения (67,5 и 42,42% соответственно; p=0,007). Однако следует обратить внимание на факт того, что только 25% из них завершились рождением живых детей. Частота самопроизвольных выкидышей в анамнезе оказалась статистически значимо выше у женщин с аутоиммунным тиреоидитом и составила 42,4%, а у женщин группы сравнения — 22,2% (p=0,016).
Анализ структуры гинекологической патологии показал, что у 32,5% женщин основной группы выявлен наружный генитальный эндометриоз различной степени тяжести, у 25% пациенток диагностирована миома матки различной локализации, у 25% — хронический эндометрит.
Сравнительный анализ гормонального статуса (табл. 2) на момент начала стимуляции суперовуляции позволил выявить статистически значимые различия в показателях уровня тиреотропного гормона в сыворотке крови. Несмотря на более высокие уровни тиреотропного гормона у пациенток основной группы, чем у женщин группы сравнения (2,4±1,1 и 1,76±1,3 мМЕ/л соответственно; p<0,001), определяемый уровень гормона в сыворотке крови не выходил за пределы референсных значений. Средние уровни АТ-ТПО и АТ-ТГ в сыворотке крови пациенток с аутоиммунным тиреоидитом составили 303,76±362,01 и 36,15±55,13 МЕ/мл соответственно.
Таблица 2. Характеристика гормонального статуса обследованных женщин до начала овариальной стимуляции в протоколах экстракорпорального оплодотворения и экстракорпорального оплодотворения с использованием методики инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки
Table 2. Hormonal profile of the studied groups prior to initiation of controlled ovarian stimulation
| Гормональные показатели | Группа сравнения (n=99) | (*) p-value | ||||||
| Me | LQ | UQ | M±SD | Me | LQ | UQ | ||
| ФСГ, мМЕ/мл | 8,0 | 5,64 | 9,5 | 7,1±2,2 | 7 | 5,7 | 8,54 | 0,209 |
| ЛГ, мМЕ/мл | 4,76 | 3,31 | 6,8 | 5,9±3,0 | 5,73 | 4,17 | 7,14 | 0,099 |
| Эстрадиол, пмоль/л | 181 | 86,5 | 259 | 168,5±140,3 | 135 | 78 | 218 | 0,381 |
| Свободный T4, пмоль/л | 12,6 | 11,5 | 15,11 | 11,98±6,78 | 12,2 | 10,9 | 13,81 | 0,075 |
| Пролактин, мкМЕ/мл | 279,8 | 182 | 439 | 362,73±133,5 | 340 | 243 | 427 | 0,2355 |
| Прогестерон, нмоль/л | 17,76 | 9,8 | 34,75 | 22,55±22,92 | 15,1 | 5,5 | 31,5 | 0,483 |
| Тестостерон, пмоль/л | 1,18 | 0,8 | 1,89 | 2,45±5,65 | 1,25 | 0,87 | 1,7 | 0,874 |
Примечание. (*) — U-критерий Манна—Уитни; различия в группах статистически значимые при уровне p<0,05; M±SD — среднее значение и стандартное отклонение; Me — медиана; LQ — нижний квартиль; UQ — верхний квартиль; ФСГ — фолликулостимулирующий гормон; ЛГ — лютеинизирующий гормон; T4 — тироксин.
При оценке параметров овариального резерва средние значения антимюллерова гормона (АМГ) оказались статистически значимо ниже у женщин с антитиреоидными антителами (2,72±2,5 нг/мл), чем у женщин с бесплодием, не имеющих антител (4,78±4,46 нг/мл; p=0,0031). Кроме того, необходимо обратить внимание на статистически значимое меньшее количество антральных фолликулов у исследуемых основной группы по сравнению с аналогичным показателем у пациенток группы сравнения (8,57±4,15 и 12,31±7,73 соответственно; p=0,0074). Более того, в ходе корреляционного анализа нами выявлена обратная взаимосвязь между титром антитиреоидных антител в сыворотке крови и показателями овариального резерва (уровень АМГ, количество антральных фолликулов) (Rs= –0,28 и –0,32 соответственно; p<0,001). Таким образом, нами получены данные о снижении параметров овариального резерва у пациенток с аутоиммунным поражением щитовидной железы (рис. 1).
Рис. 1. Средняя концентрация антимюллерова гормона и количества антральных фолликулов у обследованных женщин.
0 — группа сравнения; 1 — основная группа. Различия в группах статистически значимые при уровне p<0,05.
Fig. 1. Mean AMH concentration and AFC in the studied groups.
0 — comparison group; 1 — main group. The differences in the groups are statistically significant at the level of p<0.05
Анализ эффективности стимуляции суперовуляции в процессе настоящего исследования не выявил статистически значимых различий в длительности стимуляции и суммарной дозе гонадотропинов между исследуемыми обеих групп. При этом эффективная доза гонадотропинов, используемых в протоколе, оказалась статистически значимо выше у женщин основной группы, чем у пациенток группы сравнения (p=0,008), и положительно коррелировала с сывороточным содержанием аутоантител к ткани щитовидной железы (Rs=0,31; p<0,001) (табл. 3). Следует отметить, что у 62,5% женщин основной группы выявлен субоптимальный ответ на стимуляцию суперовуляции, что существенно выше, чем у женщин группы сравнения (32,32%; p<0,05), при этом в группах доля пациенток с низким или нормальным ответом статистически значимо не различалась (рис. 2). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о снижении эффективности стимуляции овуляции в программах ВРТ у пациенток с наличием антитиреоидных аутоантител, даже при эутиреоидном статусе.
При анализе эмбриологического этапа программ ВРТ установлено, что у женщин — носительниц антитиреоидных антител по сравнению с женщинами без антител к ткани щитовидной железы имело место статистически значимое снижение количества полученных ооцитов (7,75±7,15 и 11,89±9,08 соответственно; p<0,05), доли зрелых ооцитов (6,9±7,24 и 10,18±7,75 соответственно; p<0,05), двупронуклеарных зигот (5,05±4,72 и 8,52±7,28 соответственно; p<0,005), эмбрионов хорошего качества на 3-и (2,7±3,24 и 4,42±4,47 соответственно; p<0,05) и на 5-е (1,4±2,38 и 3,3±4,66 соответственно; p<0,05) сутки культивирования, а также криоконсервированных эмбрионов (1,65±2,65 и 3,17±4,61 соответственно; p<0,05) (рис. 3). Кроме того, прослеживается обратная связь между уровнем антитиреоидных антител в сыворотке крови и количеством полученных ооцитов (Rs= –0,31; p<0,001), долей зрелых ооцитов MII (Rs= –0,38; p<0,001), количеством двупронуклеарных зигот (Rs= –0,31; p<0,001) и количеством криоконсервированных эмбрионов (Rs= –0,23; p<0,01).
Таблица 3. Сравнительная характеристика показателей эффективности стимуляции суперовуляции обследованных женщин в протоколах экстракорпорального оплодотворения и экстракорпорального оплодотворения с использованием методики инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки
Table 3. Comparison of controlled ovarian stimulation efficacy in the setting of IVF (IVF/ICSI) between the groups
| Параметр | Основная группа (n=40) | Группа сравнения (n=99) | (*) p-value | ||||
| Me | LQ | UQ | Me | LQ | UQ | ||
| Суммарная доза гонадотропинов (ФСГ), МЕ | 2062,5 | 1625 | 2512,5 | 1800 | 1450 | 2400 | 0,158 |
| Средняя доза гонадотропинов (ФСГ), МЕ | 225 | 179,17 | 300 | 219,64 | 150 | 383,33 | 0,233 |
| Эффективная доза гонадотропинов (ФСГ), МЕ | 340,18 | 174,38 | 566,67 | 200 | 97,22 | 500 | 0,008 |
| Длительность стимуляции, дни | 9 | 8 | 10 | 9 | 8 | 10 | 0,775 |
Примечание. (*) — U-критерий Манна—Уитни; различия в группах статистически значимые при уровне p<0,05; Me — медиана; LQ — нижний квартиль; UQ — верхний квартиль; ФСГ — фолликулостимулирующий гормон.
Рис. 2. Характеристика ответа яичников на контролируемую овариальную стимуляцию у обследованных женщин в протоколах экстракорпорального оплодотворения и экстракорпорального оплодотворения с использованием методики инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки.
(*) — критерий χ2 Пирсона; различия в группах статистически значимые при уровне p<0,05.
Fig. 2. Ovarian response characteristics to controlled ovarian stimulation in the settings of IVF/IVF-ICSI treatment in both groups.
(*) — Pearson’s criterion χ2; differences in groups are significant at the significance level p<0.05.
Рис. 3. Сравнительная характеристика показателей эмбриологического этапа протоколов экстракорпорального оплодотворения и экстракорпорального оплодотворения с использованием методики инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки у обследованных женщин.
(*) — U-критерий Манна—Уитни; различия в группах статистически значимые при уровне p<0,05; * — p<0,05; ** — p<0,01; *** — p<0,001.
Fig. 3. Comparison of assisted reproductive technology characterictics and outcomes between the groups.
(*) — Pearson’s criterion χ2; differences in groups are significant at the significance level p<0.05; * — p < 0.05, ** — p < 0.01, *** — p < 0.001.
Анализ целевой эффективности программ ЭКО/ЭКО-ИКСИ) (рис. 4) показал статистически значимое снижение основных изучаемых показателей у носительниц антитиреоидных антител по сравнению с аналогичными показателями у женщин группы сравнения: частоты имплантации (18 и 34,7%; p<0,05), достижения клинической беременности (25 и 45,92%; p<0,05) (см. рис. 4). При этом частота отмены переносов эмбрионов статистически значимо не различалась между обеими группами (20% в основной группе и 25,2% в группе сравнения; p=0,51), так же, как и толщина эндометрия (9,9±1,54 и 9,52±1,79 мм соответственно; p=0,351).
Рис. 4. Показатели результативности лечения бесплодия у женщин исследуемых групп в программах экстракорпорального оплодотворения и экстракорпорального оплодотворения с использованием методики инъекции сперматозоида в цитоплазму яйцеклетки.
* — критерий χ2 Пирсона; различия в группах статистически значимые при уровне p<0,05.
Fig. 4. Comparison of clinical outcomes of IVF/IVF-ICSI treatment between the groups.
* — Pearson’s criterion χ2; differences in groups are significant at the significance level p<0.05
Обсуждение
Исследование потенциальной роли изолированного носительства аутоантител в генезе нарушений функции репродуктивной системы женщины особенно актуально в случаях бесплодия идиопатического генеза.
На сегодняшний день исследования, оценивающие зависимость параметров овариального резерва при носительстве антитиреоидных аутоантител, характеризуются разрозненностью и фрагментарностью. Высказывается предположение о том, что аутоиммунные поражения щитовидной железы являются частью полиэндокринных синдромов 1-го и 2-го типов и сопровождаются поражением эндокринных желез непосредственно в структуре репродуктивной системы [8]. В своем исследовании C. Chen и соавт. определили, что частота носительства АТ-ТПО значительно различалась в группах со сниженным, нормальным и высоким овариальным резервом (22,7, 14 и 10,3% соответственно; p<0,05,) после исключения из исследования женщин с известными причинами сниженного овариального резерва [4]. В ходе настоящего комплексного исследования при прочих равных условиях у женщин, вступающих в протокол ЭКО/ЭКО-ИКСИ, установлено статистически значимое снижение основных показателей овариального резерва: значений уровня АМГ в сыворотке крови и количества антральных фолликулов только у женщин с аутоиммунным поражением щитовидной железы.
В 2011 г. группой итальянских ученых выдвинута еще одна гипотеза о возможном прямом механизме цитотоксического действия антитиреоидных аутоантител на фолликул и, как следствие, на состояние будущего эмбриона. Авторами впервые выявлено присутствие АТ-ТПО и АТ-ТГ в фолликулярной жидкости женщин с подтвержденным диагнозом аутоиммунного тиреоидита и установлено наличие прямой корреляции между сывороточными и фолликулярными уровнями аутоантител [9]. Таким образом, авторы сделали заключение о способности свободного прохождения аутоантител к ткани щитовидной железы через гематофолликулярный барьер и предположили, что названные аутоантитела обладают способностью связываться непосредственно с антигенами zona pellucida, негативно отражаясь на качестве ооцита и, следовательно, эмбриона. В более поздних работах ряда авторов [1, 2, 10] продемонстрированы данные о снижении частоты оплодотворения, количества эмбрионов оптимального качества и частоты наступления клинической беременности у женщин-носительниц антитиреоидных аутоантител, несмотря на состояние эутиреоза. Полученные нами данные согласуются с результатами других исследователей и позволяют подтвердить предположение о непосредственном влиянии антитиреоидных антител на ооцит и качество преимплантационного эмбриона.
В нашем исследовании частота самопроизвольного прерывания беременности раннего срока в анамнезе оказалась статистически значимо выше среди пациенток с аутоиммунным тиреоидитом и почти в 2 раза превышала аналогичные показатели в группе сравнения. Возможно, это объясняется непосредственным эмбриотоксическим влиянием аутоантител к ткани щитовидной железы на трофобласт, приводящим к снижению его инвазии и препятствующим нормальному развитию плаценты и плода [11, 12]. Так, например, в экспериментальном исследовании на мышах, иммунизированных человеческим IgG против тиреоидной пероксидазы, отмечено снижение массы плодов и плацент и, как следствие, задержка развития беременности [13]. Еще в одном экспериментальном исследовании иммунизация мышей человеческим тиреоглобулином приводила к иммунному распознаванию плацентарных антигенов АТ-ТГ, отражаясь в снижении массы плодов и плацент [11].
Ряд авторов объясняют нарушение процессов имплантации повышением активности NK-клеток [14, 15]. Выявлена прямая взаимосвязь между наличием АТ-ТПО и возрастанием активности NK-клеток, их цитотоксических свойств и преобладанием проинфламматорных реакций у женщин с бесплодием и повторными неудачами имплантации в протоколах ЭКО. Более того, авторы заявляют о том, что описанные изменения имеют место на самых ранних стадиях заболевания, когда болезнь может быть обнаружена на этапе предгравидарной подготовки [14]. В ходе нашего исследования мы не проводили целенаправленное изучение состояния эндометрия у женщин обеих клинических групп, но, согласно полученным клиническим результатам, более низкие показатели имплантации отмечены у женщин — носительниц антитиреоидных антител в сопоставлении с пациентками группы сравнения.
Выводы
Несмотря на то что роль антитиреоидных антител в снижении эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий и ранних репродуктивных потерях все еще остается до конца невыясненной, по результатам проведенного исследования можно предположить, что носительство антитиреоидных антител является одним из маркеров «нарушений репродуктивной функции аутоиммунного генеза», сопровождающихся сочетанным носительством аутоантител к антигенам органов репродуктивной системы: гранулезным клеткам, непосредственно ооцита, эндометрия, таким образом обусловливая снижение суммарной эффективности программ вспомогательных репродуктивных технологий. Изложенное свидетельствует о необходимости разработки исследовательской панели репродуктивнозначимых антител с целью верификации аутоиммунного процесса в генезе репродуктивных неудач с дальнейшей разработкой патогенетического метода терапии этого состояния.
Участие авторов:
Концепция и дизайн исследования — Сафарян Г.Х., Гзгзян А.М.
Сбор и обработка материала — Сафарян Г.Х., Бородина Е.С., Лесик Е.А., Комарова Е.М., Ищук М.А.
Статистический анализ данных — Сафарян Г.Х., Нгуен К.Т.
Написание текста — Сафарян Г.Х., Гзгзян А.М., Крихели И.О., Ниаури Д.А., Коган И.Ю., Объедкова К.В., Джемлиханова Л.Х., Айламазян Э.К., Шенфельд И.
Редактирование — Гзгзян А.М., Ниаури Д.А., Коган И.Ю., Крихели Объедкова К.В., Джемлиханова Л.Х., Айламазян Э.К., Шенфельд И.
Источник финансирования. Работа поддержана грантом Правительства РФ (договор №14.W03.31.0009 от 13.02.17) о выделении гранта для государственной поддержки научных исследований, проводимых под руководством ведущих ученых.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.
Этические правила и нормы. Исследование выполнено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации Всемирной ассоциации «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека», действующими порядками и стандартами оказания медицинской помощи и другими применимыми регуляторными требованиями к проведению клинических исследований и наблюдательных программ в Российской Федерации. Протокол наблюдения пациенток и программа обследования одобрены локальным этическим комитетом. До включения в исследование у всех участниц получено письменное информированное добровольное согласие.