Морфологическая и иммуногистохимическая характеристика состояния эндометрия у пациенток со сниженным овариальным резервом

Женское бесплодие, являясь одной из ключевых проблем современной медицины, встречается с частотой от 8 до 18% в различных странах мира [1]. В России каждая 6-я пара сталкивается с этой проблемой [2]. Успешность лечения бесплодия при снижении овариального резерва с использованием как консервативных, так и хирургических технологий определяется в том числе маточным фактором, который может быть принципиальным препятствием на пути к достижению беременности.

Эффективность программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) во многом обусловлена полноценной имплантацией эмбриона, которая, в свою очередь, зависит непосредственно от функционального состояния эндометрия [3]. В настоящее время гистероскопия является «золотым стандартом» изучения состояния полости матки и используется и для уточнения характера, и для лечения внутриматочной патологии. Такой метод визуального контроля совместно с морфологической оценкой состояния слизистой оболочки матки с позиции верификации органических изменений (гиперпластических процессов, воспалительных изменений, нарушений функциональной активности желез и др.), наряду с оценкой состояния овариальной ткани, позволяет определять тактику ведения больных, выбирать метод лечения, а также проводить контроль его эффективности [4].

В литературе не представлены систематические статистически значимые данные об особенностях состояния эндометрия у больных со сниженным овариальным резервом, поэтому требуются особая оценка и специальное изучение взаимосвязи состояния овариальной ткани и эндометрия у пациенток с отсутствием эффекта от ранее проведенного лечения, включая методы ВРТ.

Преждевременная недостаточность яичников (ПНЯ), представляющая собой крайнюю степень снижения овариального резерва, определяется как гипогонадизм в возрасте до 40 лет у женщин, ранее имевших нормальный менструальный цикл. Данный диагноз может быть верифицирован путем получения минимум двух результатов повышенного уровня фолликулостимулирующего гормона (>25 МЕ/л) с интервалом 4 нед. Частота этой нозологии колеблется от 1 до 13% [5—7]. «Бедный» ответ на стимуляцию функции яичников — это созревание менее трех фолликулов при стимуляции высокими дозами гонадотропинов [8]. При этом клиническая эффективность программ экстракорпорального оплодотворения определяется не только получением достаточного числа ооцитов, но и состоянием эндометрия, от которого зависит исход переноса эмбриона в полость матки и беременности при ее наступлении. В связи с этим необходим поиск механизмов воздействия на эндометрий не только на этапе стимуляции функции яичников, во время переноса эмбриона, но и в посттрансферном периоде с целью повышения эффективности лечения бесплодия у этой категории пациенток. Именно группа больных с ПНЯ и «бедным ответом» на стимуляцию функции яичников представляет особый интерес при условии исключения генетических изменений, лежащих в основе такого состояния.

Для реализации программы восстановления репродуктивной функции у женщин с ПНЯ и при «бедном ответе» на стимуляцию их функции нами разработана тактика, включающая комплексную оценку жалоб, данных анамнеза, параметров клинико-гормонального статуса, гормонального профиля, исключения генетических факторов, ультразвуковой характеристики состояния овариального резерва и полости матки с проведением лапароскопии, гистероскопии и патоморфологического исследования эндометрия и ткани яичников. Ключевым моментом лечения является оперативное вмешательство — одноэтапный хирургический метод активации функции яичников [9, 10].

Цель исследования — повышение эффективности лечения бесплодия у пациенток со сниженным овариальным резервом путем изучения морфологических и иммуногистохимических маркеров состояния эндометрия.

Исследовано состояние полости матки и эндометрия у 20 пациенток репродуктивного возраста с бесплодием, ассоциированным со сниженным овариальным резервом, резистентным к стандартным методам лечения, включая ВРТ. Проведена гистероскопия, биопсия эндометрия с последующим морфологическим и иммуногистохимическим исследованием в рамках выполнения одноэтапного хирургического метода активации функции яичников.

Всем обследованным после получения информированного добровольного согласия на участие в исследовании выполнено оперативное вмешательство в следующем объеме: лапароскопия, ревизия органов малого таза, биопсия коркового слоя обоих яичников с последующей его фрагментацией и одноэтапной реимплантацией в толщу яичника, гистероскопия, биопсия эндометрия, хромогидротубация.

Показания к операции: бесплодие, сниженный овариальный резерв, настойчивое желание пациентки реализовать репродуктивную функцию с использованием собственных ооцитов, а также отсутствие эффекта от проводимого ранее лечения, включая методы ВРТ.

Критерии включения в исследование: возраст до 42 лет, отсутствие операций на яичниках в анамнезе, отсутствие сопутствующих гинекологических заболеваний, нормальный кариотип; отсутствие тяжелых форм патозооспермии (в том числе в сперме, полученной оперативным путем) у партнера.

Пациентки с клиническими и ультразвуковыми признаками патологии эндометрия исключены из данного исследования.

Предоперационное гормональное лечение. Пациентки получали заместительную гормональную терапию (эстрадиола валерат 2 мг + дидрогестерон 10 мг) в течение 2—3 менструальных циклов до операции с целью нормализации уровней гонадотропинов и эстрадиола и повышения эффективности комплексного лечения. Прием гормональной терапии прекращался за сутки до операции и возобновлялся через день после вмешательства.

Гистологическое исследование соскобов слизистой оболочки тела матки проведено в Первом патологоанатомическом отделении ФГБУ «НМИЦ АГП им. В.И. Кулакова» Минздрава России (руководитель отделения — д.м.н. А.В. Асатурова) по стандартным методикам. Материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, подвергали обработке с помощью аппарата гистологической проводки тканей фирмы Sakura (Япония) и заливали в парафин. Суммарная продолжительность фиксации материала, проводки и заливки в парафин не превышала 24 ч. Для морфологического исследования из каждого блока получали 3—5 ступенчатых срезов. Для гистологического исследования депарафинированные срезы толщиной 4 мкм окрашивали гематоксилином и эозином. Иммуногистохимическое исследование проведено с использованием биомаркеров LATS1 — клон ab39250, RTU (Abcam, США), MST1 — клон EP274, разведение 1:100 (Epitomics, США), YAP — клон QBend10, RTU (Ventana Medical Systems, Inc., США) и PTEN (клон A2B1) по стандартной методике на автоматическом иммуногистостейнере Ventana Benchmark Ultra (Ventana Medical Systems, Inc., США) в 20 образцах слизистой оболочки тела матки. Все препараты оцифрованы с помощью сканирующего микроскопа Aperio (Leica, Германия). Подсчет экспрессии осуществлялся количественным методом с использованием программного обеспечения ImageJ (открытый доступ), вычисление интенсивности экспрессии оценивалось с помощью определения оптической плотности и измерялось в условных единицах (УЕ) от 0 до 255. Для унификации полученных результатов и для возможности сопоставления их с данными литературы и атласом экспрессии тканевых маркеров в нормальных тканях человека количественная оценка экспрессии ранжирована и переведена в балльную систему (от 0 до 3 баллов, где оптической плотности 0 УЕ соответствовала интенсивность экспрессии 0 баллов, 1—20 УЕ — 1 балл (слабая экспрессия), 20—60 УЕ — 2 балла (умеренная экспрессия), 60 и более УЕ — 3 балла (сильная экспрессия) в соответствии с данными D. Fuhrich и соавт [11].

В исследование включены 20 пациенток, которым проведено оперативное вмешательство в следующем объеме: лапароскопия, ревизия органов малого таза, биопсия коркового слоя обоих яичников с последующей его фрагментацией и одноэтапной реимплантацией в толщу яичника. Одновременно для уточнения наличия других факторов бесплодия и повышения эффективности лечения проводили гистероскопию, биопсию эндометрия с гистологической верификацией диагноза. Во всех случаях выполнено патоморфологическое и иммуногистохимическое исследование эндометрия, полученного в ходе оперативного вмешательства.

У 15 (75%) из 20 пациенток морфологическая картина эндометрия соответствовала дню менструального цикла и не противоречила его гистологической характеристике на фоне заместительной гормональной терапии (рис. 1 на цв. вклейке). При этом в соскобе из полости матки определялась слизистая с прямыми железами и узким просветом, эпителий желез высокий, цилиндрический, многорядный с незначительным количеством митозов. Строма состояла из мелких округлых и веретенообразных клеток с незначительной инфильтрацией лимфоцитами. Отмечалось слабое развитие спиральных артерий, что соответствовало фазе ранней/средней пролиферации.

Рис. 1. Ткань эндометрия, окраска гематоксилином и эозином, ×100.

Fig. 1. Endometrial tissue, stained with hematoxylin-eosin, ×100.

У 5 (25%) пациенток при патоморфологическом исследовании выявлена картина хронического эндометрита, представленная рассеянной инфильтрацией лимфоцитами в строме, лимфоидными инфильтратами вокруг желез и сосудов, единичными эозинофилами у 3 из них, наличием псаммозных телец у 1 пациентки, фиброзом стромы и атрофией желез в одном из образцов.

Определяли степень экспрессии белков Hippo сигнального пути (YAP, MST-1, LATS-1) (рис. 2—4 на цв. вклейке) и ингибитора фосфоинозитол-3-киназного сигнального пути — PTEN (рис. 5 на цв. вклейке) в строме и железистом компоненте эндометрия. Отмечен следующий уровень экспрессии: YAP от 19,42 до 24,48 УЕ (1—2 балла) в строме и от 26,63 до 40,43 УЕ (1—2 балла) в железах эндометрия; MST-1 от 14,64 до 29,68 УЕ в строме (1—2 балла), 18,13—41,28 УЕ (1—2 балла) в железистом компоненте; LATS-1 18,27—35,94 УЕ (1—2 балла) и от 40,73 до 71,41 УЕ (2—3 балла) в строме и железах эндометрия соответственно. Экспрессия PTEN составила 25,53—52,67 (2 балла) УЕ в строме и 18,02—38,71 УЕ (1—2 балла) в железах слизистой тела матки.

Рис. 2. Экспрессия YAP в железистом компоненте эндометрия.

Fig. 2. Immunohistochemical expression of YAP in the glandular component of the endometrium.

Рис. 3. Экспрессия MST-1 в железистом компоненте эндометрия.

Fig. 3. Immunohistochemical expression of MST-1 in the glandular component of the endometrium.

Рис. 4. Экспрессия LATS-1 в железистом компоненте эндометрия.

Fig. 4. Immunohistochemical expression of LATS-1 in the glandular component of the endometrium.

Рис. 5. Экспрессия PTEN в железистом компоненте эндометрия.

Fig. 5. Immunohistochemical expression of PNEN in the glandular component of the endometrium.

Таким образом, экспрессия в железах характеризовалась статистически значимо более высоким уровнем по всем перечисленным маркерам, кроме PTEN, уровень экспрессии которого был статистически значимо выше в строме эндометрия (p<0,05).

У трех пациенток, при морфологической оценке эндометрия которых выявлены признаки хронического эндометрита, уровень экспрессии указанных выше белков характеризовался следующими показателями: YAP — 21,94; 19,85; 23,3 УЕ (1—2 балла) в строме, 35,41; 35,53; 34,21 УЕ (2 балла) в железах, MST-1 — 29,68; 29,07; 19,2 УЕ (1—2 балла) в строме 41,28; 36,32; 20,63 УЕ (2 балла) в железах, LATS-1 — 25,37; 35,94; 20,33 УЕ (2 балла) в строме 57,87; 57,5; 57,09 УЕ (2 балла) в железах, PTEN — 36,66; 26,8; 37,34 УЕ (2 балла) в строме и 27,13; 21,77; 21,37 УЕ (2 балла) в железах слизистой оболочки тела матки.

У пациентки, в соскобе из полости матки которой обнаружены псаммозные тельца, выявлен следующий уровень экспрессии в строме/железах эндометрия: YAP — 23,42/32,36 УЕ (2 балла); MST-1 — 27,34/34,62 УЕ (2 балла); LATS-1 — 34,41/49,41 УЕ (2 балла); PTEN — 52,67/33,8 УЕ (2 балла).

У 15 пациенток, морфологическая структура эндометрия которых характеризовалась нормальным строением, уровень экспрессии маркеров разнился в следующих пределах: YAP от 19,42 до 24,48 УЕ (1—2 балла) в строме и 29,57—40,43 УЕ (2 балла) в железах; MST-1 — 16,1—26,53 УЕ (1—2 балла) в строме 18,13—38,39 УЕ (1-2 балла) в железах; LATS-1 — 18,27—28,76 УЕ (1—2 балла) в строме и 40,73—71,41 (2—3 балла) УЕ в железистом компоненте соответственно. Уровень экспрессии PTEN определялся в пределах 24,02—46,47 УЕ (1—2 балла) в стромальном и 18,02—38,71 УЕ (1—2 балла) в железистом компоненте соответственно.

Данное исследование направлено на изучение состояния эндометрия у пациенток со сниженным овариальным резервом, ассоциированным с ПНЯ и «бедным» ответом на стимуляцию функции яичников. В рамках комплексного лечения бесплодия у 20 больных произведена гистероскопия с биопсией эндометрия и последующим гистологическим исследованием операционного материала.

Примечательно, что у большинства (75%) больных эндометрий имел нормальное строение и соответствовал фазе менструального цикла, что свидетельствует о возможности имплантации эмбриона в полость матки и наступления беременности самопроизвольно или на фоне дальнейшего лечения с использованием методов ВРТ.

Наличие фиброза и склероза стромы с расстройствами кровообращения и атрофией желез эндометрия и иных морфологических особенностей у 25% пациенток указывает на наличие более глубоких изменений в слизистой оболочке тела матки, прямо коррелирующих с длительностью нарушений менструального цикла по типу аменореи, гормональная коррекция которых характеризовалась отложенным началом (от 6 мес до 1,5 лет). Обратимость указанных изменений является спорной и требует дальнейшего изучения.

Спектр тканевых маркеров, уровень экспрессии которых изучался в рамках настоящего исследования, обусловлен принципиальным влиянием Hippo, фосфоинозитол-3-киназного сигнальных путей на различные этапы фолликулогенеза: от рекрутинга примордиальных фолликулов до селекции доминантного фолликула. Ключевым компонентом пути Hippo является киназа Yap (Yes-activated protein), которая в активном состоянии способна связывать ряд факторов транскрипции, таких как p73, p53-binding protein-2 (p53BP2), RUNX2, SMAD7, ERBB4, PEBP2а и TEAD/TEF [12].

Регуляция активности YAP осуществляется в основном за счет ингибирующего действия киназ LATS1 и LATS2 (large tumor supressor-1 и 2). Они в свою очередь активируются киназами MST1 и MST2 (mammalian sterile-20-like kinases). Для полной активации LATS и MST необходима также их связь с адапторными белками WW45 и MOB1 соответственно. Описанная выше часть сигнального пути Hippo является высококонсервативной у млекопитающих, в то время как сигналы активации или ингибирования LATS и MST могут быть достаточно разнообразными.

Рекрутирование примордиальных фолликулов в основном контролируется паракринной взаимосвязью между ооцитом, фолликулярным эпителием, соседними текальными и интерстициальными клетками. Пул покоящихся фолликулов находится под строгим контролем ингибирующих факторов, активация происходит при увеличении стимулирующего влияния. Последовательность действий во многом опосредована секретируемыми факторами роста, включая несколько членов суперсемейства трансформирующего фактора роста бета (TGF-β) [13]. Экспериментальные данные показывают, что не только внешние стимулы, но и сами ооциты в значительной степени управляют передачей сигналов, регулирующих набор и скорость роста фолликулов. Основные сигнальные пути проходят через PI3K (фосфатидилинозитол-3-киназу) [14].

Данный сигнальный путь опосредуется PTEN (фосфотензин) [6]. Отсутствие PTEN активирует PI3K с образованием фосфолипида фосфатидилинозитол-3, -4, -5-трифосфата (PIP3) и Akt (протеинкиназа B) сигнализацию. В эксперименте на PTEN-дефицитных мышах (OoPten –/–) показаны сверхактивация примордиальных фолликулов (рост достигает стадии первичных и вторичных) и раннее истощение яичников [15]. Таким образом, для реализации всех этапов фолликулогенеза с позиции индукции фолликулярного роста необходима активация фосфоинозитол-3-киназного сигнального пути при одновременной инактивации PTEN, а также прекращение передачи сигнала по Hippo-пути.

Следует отметить, что при выявлении признаков воспалительных изменений в эндометрии при морфологическом исследовании в отдельных образцах отмечается более высокий уровень экспрессии вышеуказанных тканевых маркеров, однако при совокупной оценке образцов ткани эндометрия всех пациенток, включенных в исследование, статистически значимые различия как в железистом, так и в стромальном компоненте эндометрия с позиции экспрессии иммуногистохимических маркеров не выявлены.

При сравнении полученных результатов с данными, приведенными в атласе экспрессии белков The Human Protein Atlas [16], отмечены статистически значимые различия по всем изучаемым маркерам: уровень экспрессии YAP, PTEN, LATS-1 и MST-1 в ткани эндометрия у пациенток со сниженным овариальным резервом характеризуется статистически значимо более высоким уровнем (слабая—сильная экспрессия — 1—3 балла) по сравнению с таковым в образцах эндометрия у женщин, имеющих регулярный менструальный цикл (отсутствие экспрессии—слабая экспрессия — 0—1 балл), p<0,05.

В статье приведены результаты исследования 20 пациенток репродуктивного возраста с бесплодием, ассоциированным со снижением овариального резерва. По итогам клинико-лабораторного исследования всем пациенткам рекомендована донация ооцитов как единственно возможный вариант достижения беременности. В результате комплексного лечения бесплодия с использованием одноэтапного хирургического метода активации функции яичников к настоящему моменту у 10 из 70 включенных в исследование женщин наступила беременность, период послеоперационного наблюдения составляет от 14 дней до 1,5 лет (исследование продолжается).

В ходе исследования определены особенности состояния эндометрия у женщин со сниженным овариальным резервом путем проведения гистероскопии, биопсии эндометрия с последующим патоморфологическим исследованием в рамках выполнения одноэтапного хирургического метода активации функции яичников. Хронический эндометрит установлен у 25% женщин, при этом у некоторых пациенток определены изолированные воспалительные изменения в виде отека стромы эндометрия, очагового фиброза и признаки неполноценной функциональной активности железистого компонента слизистой оболочки тела матки. Такие изменения указывают на важную роль маточного фактора бесплодия, сочетанного со снижением овариального резерва.

Более высокий уровень экспрессии тканевых маркеров LATS-1, MST-1, YAP и сниженный уровень экспрессии PTEN в железах эндометрия свидетельствуют о нарушении регуляции Hippo-сигнального пути и отсутствии компенсаторного влияния со стороны Akt-сигнального пути, главным регулятором которого является PTEN. Таким образом, у пациенток со сниженным овариальным резервом нарушено функционирование внутриклеточных сигнальных путей (прежде всего YAP и PTEN-зависимых), которое происходит как в овариальной ткани, так и в эндометрии.

Морфологическая картина слизистой оболочки тела матки не отличалась у пациенток репродуктивного возраста с регулярным менструальным циклом и у пациенток со сниженным овариальным резервом, которым в рамках лечения бесплодия проведена заместительная гормональная терапия для восстановления циклических морфологических изменений эндометрия. В то же время представленные данные экспрессии иммуногистохимических тканевых маркеров демонстрируют биологические различия ткани эндометрия, находящейся в ремоделированном состоянии на фоне приема гормональной терапии, и слизистой оболочки полости матки у пациенток, имеющих нормальный менструальный цикл.

Представленное исследование, которое носит предварительный характер, показывает высокую эффективность восстановления функции яичников в результате применения хирургической активации ткани яичников, однако также свидетельствует о необходимости изучения состояния эндометрия с последующей коррекцией и о принципиальной необходимости комплексного подхода к ведению таких больных.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflicts of interest.