Одной из глобальных проблем нашей страны является сохраняющаяся негативная демографическая ситуация, которая характеризуется как кризисная. Несмотря на внедрение в практику врача акушера-гинеколога алгоритмов прегравидарной подготовки, потери желанных беременностей остаются на прежнем уровне. Каждая 4—5-я желанная беременность прерывается, причем 70—80% — на сроке 6—8 нед гестации. Причины невынашивания беременности общеизвестны, объединены в группы, доказано их сочетанное влияние [1]. Принято считать, что успешность зачатия, течение беременности и здоровье ребенка зависят, прежде всего, от здоровья его матери [2]. Такова же позиция социума. Соответственно среднестатистический мужчина изначально и не планирует обследоваться и лечиться, считая себя абсолютно здоровым. Однако в немалой степени благодаря развитию и широкому внедрению в практику программ экстракорпорального оплодотворения, при которых в обязательном порядке исследуется сперматогенез, в последнее время в репродуктивной медицине активно изучается влияние мужского фактора на фертильность и здоровье потомства [3]. Генетический вклад родителей в здоровье своего потомства в целом одинаков и для женщины, и для мужчины. Центральное место в мужской репродуктивной сфере занимает сперматогенез. Это сложный многостадийный процесс развития и созревания сперматозоидов из незрелых половых клеток. В среднем продолжительность созревания сперматозоида занимает около двух с половиной месяцев. Нормальное протекание сперматогенеза требует скоординированного влияния многочисленных факторов (генетических, клеточных, гормональных и других). Подобная сложность делает сперматогенез «легкой мишенью» для всякого рода негативных воздействий. В супружеских парах с невынашиванием беременности нарушения сперматогенеза установлены у 42—58% мужчин. Существует огромное количество причин нарушения репродуктивной функции у мужчин. По своему характеру эти факторы могут быть физическими (воздействие высоких или низких температур, радиоактивное и другие типы излучения и прочее), химическими (воздействие различных токсических веществ, побочный эффект лекарств и др.), биологическими (инфекции, передающиеся половым путем, различные заболевания внутренних органов) и социальными (хронические стрессы). Лидирующее положение занимает биологический фактор, а именно инфицирование урогенитального тракта.
Цель исследования — оценить участие мужского фактора бесплодия в семейной паре путем анализа показателей спермограммы и цитокинового профиля у мужчин в супружеских парах с синдромом потери плода.
Материал и методы
Проведено обследование 471 мужчины из супружеских пар с синдромом потери плода — основная группа, которые распределены следующим образом: 1-я подгруппа — мужчины из супружеских пар со спорадическим невынашиванием беременности — 245 (52,01%); 2-я подгруппа — мужчины из супружеских пар с привычным невынашиванием беременности — 226 (47,98%). Средний возраст мужчин основной группы составил 34,2±4,1 года. Контрольную группу составили 177 мужчин из супружеских пар без репродуктивных потерь, средний возраст — 31,8±3,4 года. Для исключения влияния соматических заболеваний на секрецию тестостерона в основную группу не включали пациентов с установленными ранее любыми соматическими заболеваниями и изменением кариотипа. Всем пациентам проведено андрологическое обследование, включающее оценку полового статуса с определением объема и консистенции тестикул, пальцевое ректальное исследование, анкетирование, позволяющие оценить андрогенный статус и половую функцию. Обследование на инфекции, передающиеся половым путем, проводили согласно общепринятым стандартам. Исследование эякулята выполняли согласно протоколу ВОЗ (5-е изд., 2010). Материал для трансмиссионной электронной микроскопии фиксировали 2% глутаровым альдегидом, приготовленным на 0,1 М какодилатном буфере, pH 7,2 в течение суток при 4 °C, затем промывали в трех порциях какодилатного буфера и дегидратировали в серии спиртов возрастающей концентрации, помещали в ацетон и заливали в смесь эпоксидных смол — Epon и Araldite (Sigma-Aldrich, США). Срезы материала изготавливали на микротоме Leica EM UC6 (Leica Mikrosystems, Германия). Полутонкие срезы докрашивали 1%-ным раствором метиленового синего, ультратонкие срезы контрастировали 0,5%-ным водным раствором ацетат уранила и цитратом свинца по Рейнольдсу (1963). Весь гистологический материал анализировали с помощью светового микроскопа Axio Imager (Carl Zeiss, Германия). Ультратонкие срезы исследовали на электронном микроскопе Libra 120 (Carl Zeiss, Германия). Определение уровня ИЛ-10, ИЛ-13, ИФНγ в сыворотке крови и эякуляте проводили с помощью специфических реактивов фирмы R & D Diagnostics, Inc. (США) методом сэндвич-варианта твердофазного иммуноферментного анализа. Учет результатов производили с помощью иммуноферментного анализатора Multiscan (Финляндия). Расчеты количества цитокина проводили путем построения калибровочной кривой с использованием компьютерной программы. Количество выражали в пг/мл. Анализ полученных результатов проводили при помощи программы SPSS v.16. методом вариационной статистики с использованием двухвыборочного t-критерия Стьюдента и критерия Манна—Уитни (pu). При нормальном распределении случайные величины указывали в виде среднего значения, стандартного отклонения (Х±σ). Количественные признаки, не имеющие нормального распределения, оценивали с помощью непараметрических методов и представили в виде медианы (Me), 25%-го и 75%-го квартилей (Q25; Q75), минимального (min) и максимального (max) значений. Для выявления взаимосвязи между переменными использован коэффициент корреляции рангов Спирмена. Уровень статистической значимости, при котором отклонялись нулевые гипотезы, составлял менее 0,05.
Результаты
В ходе настоящего исследования выявлено, что у мужчин частота встречаемости патоспермии составила 89% случаев. Наиболее частыми отклонениями сперматогенеза явились тератозооспермия за счет аномальных включений в хроматин головки сперматозоида — вакуолей, уменьшение размеров акросомы и также наличие вакуолей, и астенозооспермия за счет агглютинации и агрегации, а не за счет изменений анатомии хвоста сперматозоида, что согласуется с данными литературы [4].
В ходе настоящего исследования установлено, что ведущим причинным фактором патоспермии явились инфекции половых путей. При этом в структуре вирусных инфекций преобладала папилломавирусная (60,5%) и несколько более трети (39,5%) приходилось на долю герпесвирусов. В структуре папилломавирусной инфекции (ВПЧ) лидировали 6, 52 и 18 штаммы (соответственно 40,7; 27,1 и 12,7%), в структуре герпесвирусной инфекции — вирус простого герпеса 2-го типа, цитомегаловирус и вирус Эпштейна—Барр (соответственно 70,2; 10,4 и 9,1%).
У 45,2% обследованных мужчин обнаружены C. trahomatis, у 4,8% — Tr. vaginalis, у 16,1% — M. genitalium. Среди микроорганизмов, которые традиционно относят к условно-патогенным, чаще всего выявляли U. urealyticum (85,5%), M. hominis (43,5%). U. parvum (37,1%) и S. epidermidis (24,2%). Наиболее частыми ассоциациями были герпетическая, папилломавирусная инфекции в сочетание с хламидийной.
Всем супружеским парам проведено специфическое лечение инфекций, передающихся половым путем, по стандартным методикам. Проведен контроль излеченности в соответствии с общепринятыми алгоритмами. Критерием излеченности мужчин являлась нормализация сперматогенеза, т.е. вхождение показателей спермограммы в допустимый физиологический коридор по данным критериев ВОЗ (5-е издание) и отсутствие патогенной микрофлоры урогенитального тракта, выявленной при первичном обследовании.
Однако при наступлении планированной беременности в 11% случаев эмбрио-фетопотери повторились. Перед нами встала задача поиска способа для контроля нормализации сперматогенеза путем детального обследования качества эякулята. Методом выбора стала электронная микроскопия.
Известно, что сперматозоид человека состоит из трех основных анатомических регионов: головки, средней части, или шейки, и жгутика. Весь сперматозоид окружен плазматической мембраной. Головка содержит хроматин, плотно упакованный. Плотная упаковка необходима для более компактной формы клетки и, как следствие, уменьшения энергетических затрат на продвижение сперматозоида по половому тракту. Головка сперматозоида имеет акросому — мембранный мешочек с протеолитическими ферментами, необходимыми для проникновения через оболочки ооцита в процессе оплодотворения. Под акросомой расположена постакросомальная пластинка, которая является точкой инициации слияния мембран ооцита и сперматозоида. Ядро сперматозоида лежит на так называемой базальной пластинке у основания головки — место соединения головки и шейки. В шейке сперматозоида находятся митохондрии, спиралевидно располагаясь вокруг аксонемы, они обеспечивают энергией, необходимой для движения жгутика. При исследовании ультраструктур сперматозоидов в нормальном сперматозоиде не обнаружено дополнительных включений в виде вакуолей, изломов продольных направлений, наличия дополнительных частиц на мембране сперматозоида.
При ультраструктурном исследовании сперматозоидов пациентов обеих исследуемых групп обнаружены сперматозоиды преимущественно с дефектной морфологией. А именно, в ядрах хроматин грубозернистый, ядерная мембрана прерывистая, цитоплазма вакуолизирована, преобладали сперматозоиды с микроголовками и цитоплазматической каплей. Эти сперматозоиды не могут принимать участие в оплодотворении, так как сперматозоиды с микроголовками — половые клетки с редуцированным геномом, а с цитоплазматической каплей — незрелые формы [5]. В цитоплазме этих клеток обнаружены вирусные частицы размером 50—90 нм (рис. 1, 2), от 1 до 10. Вирусные частицы наблюдались как отдельно (см. рис. 1), так в скоплениях в вакуолях цитоплазмы. Вирусные частицы обнаружены также в вакуолях и на поверхности ядер сперматозоидов.
Рис. 1. Формирование вирусных частиц вируса простого герпеса в ядре сперматозоида.
Окраска гематоксилином и эозином, ×16 000.
Рис. 2. Скопление вирусных частиц в цитоплазме сперматозоида.
Окраска гематоксилином и эозином, ×16 000.
Одновременно с тем в вакуолях цитоплазмы исследованных образцов выявлены бактерии — хламидии (рис. 3). Это согласуется с данными литературы [5], которые доказывают, что воспалительные процессы сопровождаются прикреплением хламидий к сперматозоидам, в результате этого они поражают 33—45% сперматозоидов, а среднее число возбудителей на одном сперматозоиде достигает трех. В нашем исследовании выявлено также и внутриядерное бактериальное поражение.
Рис. 3. Хламидия, окруженная многослойной мембраной, в вакуоли цитоплазмы сперматоцита.
Ув. 20 000. Окраска гематоксилином и эозином.
При изучении количественных и качественных показателей спермограмм мужчин основной группы установлено статистически значимое снижение общей подвижности сперматозоидов, а также количества сперматозоидов с прогрессивным движением у пациентов обеих исследуемых подгрупп по сравнению с мужчинами контрольной группы. Количество неподвижных форм и форм с непрогрессивным движением значительно превышало референсные значения (pu<0,001) (табл. 1). Необходимо отметить, что у пациентов обеих исследуемых подгрупп зарегистрировано значительное снижение уровня лимонной кислоты. Самый низкий уровень этого показателя определен у пациентов 2-й подгруппы, что может свидетельствовать о значительном угнетении функции предстательной железы.
Таблица 1. Показатели спермограмм мужчин с хроническим уретритом
| Показатель спермограммы | Больные с уретритом | Контрольная группа (n=177) | ||
| 1-я подгруппа (n=245) | 2-я подгруппа (n=226) | |||
| Объем, мл | ≥1,5 | 3,05±0,36 | 3,83±0,47 | 3,1±0,39 |
| Вязкость, см | до 2 | 1,06±0,18 | 1,13±0,16 | 1,18±0,15 |
| Время разжижения, мин | 15—60 | 10,65±1,6** | 13,73±1,5 | 25,0±4,47 |
| Кислотность, рН | 7,2—7,8 | 7,65±0,04 | 7,71±0,05 | 7,32±0,11 |
| Концентрация в 1 мл эякулята, млн | ≥15 | 126,59±13,07 | 97,93±11,74 | 97,6±21,39 |
| Лимонная кислота, ммоль/л | ≥20 | 16,29±3,05* | 14,12±1,99*** | 24,6±0,97 |
| Фруктоза, ммоль/л | ≥13 | 38,9±7,2 | 54,35±13,73 | 46,28±2,12 |
| Цинк, мкг/дл | ≥2,4 | 4,27±0,89 | 2,32±0,37 | 3,42±0,78 |
| Общее кол-во сперматозоидов, млн | ≥39 | 102,6±12,5*** | 113,4±16,5** | 277,22±53,66 |
| Морфологически нормальные формы, % | ≥4 | 80,3±4,3 | 72,7±4,9 | 82,32±3,45 |
| Аномалия головки, % | <1—25 | 19,65±4,29 | 28,73±2,68** | 16,36±2,51 |
| Общая подвижность, % | ≥40 | 60,65±3,45*** | 65,56±2,51** | 84,8±5,83 |
| Прогрессивное движение, % | ≥32 | 41,6±2,6*** | 43,0±2,9*** | 75,4±5,45 |
| Непрогрессивно подвижные, % | 26,3±3,3*** | 29,3±3,0*** | 9,40±2,10 | |
| Неподвижные, % | — | 38,1±2,6*** | 33,8±2,2*** | 15,20±1,71 |
| Жизнеспособность, % | ≥58 | 76,5±5,6 | 84,4±1,6 | 81,80±6,14 |
Примечание. * — pu<0,05; ** — pu<0,01;*** — pu<0,001 — статистически значимые различия по сравнению с показателями пациентов контрольной группы; pu1—2 — сравниваемые группы больных уретритом мужчин.
В последнее время убедительно показана роль иммунных механизмов в реализации заболеваний половой сферы инфекционного генеза, характер которых сопровождается активацией врожденного и адаптивного иммунитета, играющих важную роль в защите от инфекции.
Цитокины как молекулы короткодистантного действия при иммунном ответе практически не поступают в кровоток, поэтому в сыворотке крови их определяют в незначительных концентрациях. Не всегда есть смысл определять абсолютные показатели концентрации. Важно их соотношение. В связи с этим для обследования цитокинового статуса мы использовали не только сыворотку венозной крови пациентов, но и семенную жидкость мужчин из супружеских пар с невынашиванием беременности и без репродуктивных неудач. А также исследован регуляторный коэффициент соотношения ИФНγ и ИЛ-10+ИЛ-13 (табл. 2).
Таблица 2. Регуляторный коэффициент соотношения ИФНγ/ИЛ-10+ИЛ-13 в сыворотке венозной крови и эякуляте у мужчин контрольной и основной групп
| Коэффициент | Контрольная группа (n=177) | Основная группа (n=471) |
| ИФНγ/ИЛ-10+ИЛ-13, сыворотка венозной крови | 0,21±0,02 | 0,05±0,001***↓ |
| ИФНγ/ИЛ-10+ИЛ-13, эякулят | 0,41±0,01 | 0,25±0,02*↓#1—2 |
Примечание. * — p<0,05; *** — p<0,001 — статистически значимые различия с показателями исследуемых контрольной группы; между подгруппами: # — p<0,05; ## — p<0,01; ### — p<0,001, где 1, 2 — исследуемые подгруппы.
Значения регуляторного коэффициента в сыворотке венозной крови мужчин основной группы были ниже по сравнению с исследуемыми контрольной группы, различий между пациентами подгрупп не выявлено (см. табл. 2). В эякуляте наиболее выраженное снижение индекса ИФНγ/ИЛ-10+ИЛ-13 установлено у мужчин основной группы (p<0,01). Зафиксированные данные свидетельствует о дизрегуляции иммунного ответа на локальном и системном уровнях у этой категории пациентов.
Заключение
Проведенное исследование показало, что общепринятые критерии оценки состояния сперматогенеза по данным рутинного анализа спермы не являются окончательными. В существующей практике недооценено значение сперматозоидов мужчин, перенесших вирусную и хламидийную инфекцию половых путей, как источника инфицирования половой партнерши и причины репродуктивных потерь.
Наш опыт и результаты проведенного исследования свидетельствуют, что при истинном инфекционном генезе разницы между спонтанным и привычным невынашиванием нет, если в основе лежит вирусная инфекция или вирусно-бактериальная ассоциация.
Пути преодоления репродуктивных потерь в условиях сложной демографической ситуации — включение мужчин в обязательный алгоритм прегравидарного обследования и лечения не только у пар с бесплодием, но и в семьях с невынашиванием беременности вне зависимости от количества репродуктивных потерь.
Участие авторов:
Утверждение окончательного варианта статьи — Маркелова Е.В.
Написание текста, редактирование — Тулупова М.С.
Концепция и дизайн исследования — Хамошина М.Б.
Сбор и обработка материала — Чепурнова Н.С.
Статистическая обработка данных — Невежкина Т.А.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
The authors declare no conflicts of interest.