Синдром задержки роста плода (СЗРП) характеризует плод с предполагаемой массой менее 10-го процентиля по данным ультразвукового исследования, который вследствие патологического процесса не достиг своего биологически определенного потенциала роста. По данным ВОЗ, число новорожденных с задержкой роста колеблется от 6,5% в развитых странах Европы до 31,1% в Центральной Азии [1]. В России частота этого синдром колеблется от 2,4 до 17% [2]. СЗРП имеет большой удельный вес в структуре причин перинатальной заболеваемости и смертности, а репродуктивные потери и затраты на комплексное лечение детей с СЗРП причиняют значительный социальный и экономический ущерб. Стремление снизить перинатальную заболеваемость и смертность при СЗРП послужило поводом для поиска основных принципов ранней профилактики, своевременной диагностики и адекватной терапии данного осложнения беременности.

В патогенезе плацентарной недостаточности и развитии СЗРП доказана роль эндотелиальной дисфункции, что делает актуальным исследования полиморфизма генов компонентов ренин-ангиотензиновой системы, обмена гомоцистеина, компонентов гемостаза и эстрогеновых рецепторов как возможных молекулярных маркеров выраженных нарушений в системе мать—плацента—плод [3].

Имеются данные о роли генетически детерминированных особенностей липидного обмена у беременных, ассоциированных с риском формирования плацентарной недостаточности и развития СЗРП, что свидетельствует об актуальности исследования распространенности полиморфных вариантов генов энергообмена у женщин с плацентарной недостаточностью с исходом в СЗРП [4].

По мнению ряда авторов [5—7], отдельные генетические варианты генов имеют достаточно низкий вклад в формирование патологического фенотипа и соответственно положительные результаты ассоциации отдельных полиморфизмов с заболеваниями следует искать в сочетаниях генетических вариантов и анализировать межгенные и ген-средовые взаимодействия, играющие роль в формировании патологического фенотипа.

Цель исследования — оценка роли взаимодействия генов энергетического обмена, регуляторов фолатного цикла, компонентов системы гемостаза, регуляторов артериального давления и рецепторов эстрогена в формировании наследственного риска развития СЗРП.

Обследованы 158 пациенток с самостоятельно наступившей одноплодной беременностью со сроком гестации 20—33 нед. В ходе исследования все пациентки разделены на две группы: основная группа — 76 женщин с установленным диагнозом: беременность 31—32 нед, СЗРП II—III степени без нарушения кровообращения в системе мать—плацента—плод и контрольная группа — 82 соматически здоровых женщины с физиологически протекающей беременностью.

Средний возраст пациенток основной группы составил 27,2±0,92 года, группы контроля — 27,6±2,49 года (p>0,05).

Критерии исключения: многоплодная беременность, сахарный диабет, метаболический синдром, ВИЧ, вирусные гепатиты, гемолитическая болезнь плода, экстрагенитальная патология в стадии декомпенсации, требующая немедленного родоразрешения, плацентарная недостаточность с нарушением маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровообращения, врожденные пороки развития плода.

Всем женщинам проводилось молекулярно-генетическое исследование 26 полиморфных генов предрасположенности к СЗРП:

1. Гены энергетического обмена: PPARA 2498 G>C, PPARD -87 C>T, PPARG P12A C>G, PPARGC 1A S482G G>A, PPARGC 1B A203P G>C, AMPD Q12X G>A.

2. Гены компонентов системы гемостаза: FGB 455 G>A, F2 20210 G>A, F5 1691 G>A, PAI-1 5G>4G, ITGA2807 C>T, ITGB3 1565 T>C, F7 10976 G>A, F13A1 G>T.

3. Гены-регуляторы фолатного цикла: MTR 2756 A>G, MTRR 66 A>G, MTHFR 677 C>T, MTHFR 1298 A>C.

4. Гены-регуляторы артериального давления: AGT 704 T>C, AGT 521 C>T, AGTR1 1166 A>C, AGTR2 1675 G>A, NOS 786 T>C, NOS 894 G>T.

5. Гены рецепторов эстрогена: ESR 397 T>C, ESR 351 A>G.

Для типирования полиморфных маркеров в генах энергообмена выделяли ДНК из лейкоцитов периферической крови, используя комплект реагентов ДНК-сорб-В (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Россия). Далее проводили реакцию амплификации с помощью комплекта праймеров «Амплисенс Пироскрин» (ФБУН «Центральный научно-исследовательский институт эпидемиологии», Россия). Впоследствии проводили реакцию пиросеквенирования и анализ полученных результатов с помощью пиросеквенатора серии PyroMark Q24 («Qiagen», Германия).

Для исследования полиморфных вариантов в генах системы гемостаза, фолатного обмена, регуляторов артериального давления и рецепторов эстрогена образцы ДНК пациенток получали из цельной крови, используя коммерческие наборы реагентов и протоколы для выделения ДНК (НПО «ДНК-Технология», Россия). Генотипирование образцов проводили методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) в «режиме реального времени» со снятием кривых плавления продуктов амплификации в автоматическом режиме программного обеспечения детектирующего амплификатора ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Россия).

Статистический анализ данных проводили с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Различия между непараметрическими переменными обнаруживали при помощи критерия χ² Пирсона. Относительный риск оценивали по показателю отношения шансов (odds ratio, ОШ) с 95% доверительным интервалом (ДИ). Межгенные взаимодействия оценивали методом логистической регрессии. Нулевая гипотеза отвергалась при р≤0,05. Тест на соответствие распределения генотипов закону Харди—Вайнберга в обеих выборках проводили с помощью критерия χ² с использованием программы Hardy—Weinberg equilibrium.

Средний возраст пациенток по группам исследования статистически значимо не различался. Социальный статус, национальная принадлежность и регион проживания были идентичными. При анализе соматического статуса пациенток исследуемых групп статистически значимых различий в частоте хронических форм заболеваний внутренних органов у беременных основной и контрольной групп не было (табл. 1).

При изучении акушерского анамнеза женщин отмечено, что статистически значимо чаще у пациенток основной группы в анамнезе были случаи самопроизвольного патологического прерывания беременности, преждевременные роды, СЗРП во время предыдущей беременности и угрожающий аборт во время данной беременности. По остальным параметрам акушерского анамнеза исследуемые группы были сопоставимы (табл. 2).

Распределение частот аллелей и генотипов по изученным вариантам генов у пациенток основной и контрольной групп соответствовало равновесию Харди—Вайнберга.

По результатам однофакторного анализа, включавшего 26 однонуклеотидных замен в генах компонентов энергетического обмена, генов регуляторов фолатного цикла, компонентов системы гемостаза, генов регуляторов артериального давления и генов рецепторов эстрогена, сравниваемые группы женщин статистически значимо различались по частоте выявления альтернативных аллелей в двух полиморфизмах: PPARA 2498 C (ОШ=3,04 при ДИ 95% 1,47—6,32; р<0,01) и MTRR 66 A (ОШ=3,51 при ДИ 95% 2—6,18; р<0,001).

Высказана гипотеза, согласно которой отдельные генетические варианты имеют достаточно низкий вклад в формирование патологического фенотипа, и положительные результаты ассоциации отдельных полиморфизмов с заболеваниями, как правило, не реплицируются через независимые выборки. В связи с этим особый интерес представляет создание возможности расчета индивидуального риска формирования СЗРП на основании данных о наличии сочетаний разных этиологических аллелей в генотипе женщины [5].

Для изучения одновременного влияния нескольких полиморфных аллелей изучаемых генов на риск развития СЗРП использована логистическая регрессионная модель. В пошаговый логистический регрессионный анализ включены 26 полиморфных вариантов генов. На основании данных многофакторного анализа сформирована модель, представляющая собой совокупность 7 генотипов. В табл. 3 представлены

Чувствительность модели составила 91%, специфичность — 78%, точность — 86%. На основании полученных расчетов можно вывести лог-линейное уравнение прогноза риска СЗРП:

X= К₁·A+К₂·B+К₃·C–К₄·D+К₅·E–К₆·F–0,07,

где A — PPARA 2498 G>C (2498GG-0, 2498GC или 2498CC-1);

B — PPARGC 1B A203P G>C (203GG-0, 203GC или 203CC-1);

C — MTRR 66 A>G (66AA или 66AG-1, 66GG-0);

D — AGT 704 T>C (704TT-0, 704TC или 704CC-1);

E — AGT 521 C>T (521CC-0, 521CT или 521TT-1);

F — NOS 894 G>T (894GG-0, 894GT или 894TT-1);

К₁, К₂, К₃, К₄, К₅, К₆ — коэффициенты.

В полученную математическую формулу необходимо подставить закодированные данные анализа полиморфизма генов — кандидатов для определения вероятности формирования СЗРП:

При Х<–0,5 вероятность низкая.

При –0,5

При Х>0,5 вероятность высокая.

В состав рассчитанной регрессионной модели вошли 6 предикторов (аллелей) формирования СЗРП II—III степени: PPARA 2498C, PPARGC 1B A203P C, MTRR 66G, AGT 704T, AGT 521T и NOS 894G. Самую большую прогностическую значимость имеет полиморфизм 2498 G>C гена PPARA. Наименьшее значение в прогнозе СЗРП в данной логистической регрессии имеет полиморфизм A203P G>C гена PPARGC 1B.

Ген PPARA кодирует один из подтипов рецепторов клеточного ядра, активируемых пролифератором пероксисом (Peroxisome Proliferator Activated Receptor), который регулирует метаболизм липидов в печени и скелетных мышцах, а также гомеостаз глюкозы. Он также выступает в качестве молекулярного сенсора эндогенных жирных кислот (ЖК) и их производных. Мутация данного гена лиганд-активируемого фактора транскрипции нарушает регуляцию экспрессии генов, кодирующих ферменты и транспортные белки, которые контролируют гомеостаз липидов, что в итоге приводит к проблемам окисления ЖК и нарушению метаболизма липопротеинов. В подтверждение данного факта у женщин с СЗРП, по результатам наших исследований, отмечается статистически значимое снижение липидов (липопротеинов низкой плотности и холестерина) [8].

Ген PGC1B (peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1 beta) кодирует белок PGC1-β, активирующий транскрипционные факторы, вовлеченные в регуляцию жирового и углеводного обменов, а также состава мышечных волокон. Продукт гена PPARGC 1A регулирует митохондриальный биогенез, гомеостаз клеточного холестерина, глюконеогенез [9].

Таким образом, сочетание в генотипе женщины этиологических аллелей 2498C гена PPARA и 203P гена PPARGC 1B может предрасполагать к снижению интенсивности энергетического обмена при беременности, нарушениям процессов липолиза, транспорта холестерина, что может привести к нарушению процессов синтеза АТФ, активации окисления ЖК (анаэрбный гликолиз) и, как следствие, к снижению общей энергетики организма. Это может способствовать нарушению нормального роста и развития плода и формированию СЗРП.

Полиморфный алллель 66А варианта гена MTRR 66A>G определяет синтез максимально активной формы фермента MTRR (метионин синтазы-редуктазы). В нашей работе аллель 66А является фактором риска СЗРП. В ранее проведенных исследованиях мы обнаружили более высокую частоту генотипа MTRR 66AА у женщин с привычным невынашиванием беременности по сравнению с репродуктивно здоровыми женщинами без случаев невынашивания в анамнезе [10]. Полученные результаты отличаются от литературных данных об ассоциации полиморфного аллеля MTRR 66G с невынашиванием беременности в исследованиях, выполненных на европейских популяциях [11—13]. Следует отметить, что частота полиморфных аллелей генов предрасположенности к мультифакториальным заболеваниям отличается в различных этнических группах [14].

Особый интерес представляет изучение вклада генов ренин-ангиотензиновой системы в формирование СЗРП в связи с тем, что ангиотензин II помимо регулирования артериального давления и водно-солевого баланса выступает также в качестве фактора роста и цитокина [15]. В полученную нами логистическую регрессионную модель вошли 2 полиморфных аллеля в гене ангиотензиногена (AGT): 704 T и 521 T. Ген AGT кодирует белок ангиотензиноген — сывороточный глобулин альфа-глобулиновой фракции, вырабатываемый в основном клетками печени, из которого под действием ренина образуется ангиотензин I. Существует около 15 различных аллельных вариантов гена AGT. Наибольшая ассоциация с развитием гипертонии показана для полиморфизма AGT 521 C>T. По данным исследований [16], выявлено увеличение риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний у носителей генотипа AGT 521СТ примерно в 5 раз. В 1992 г. показано полное сцепление полиморфных вариантов AGT 704 T>C и AGT 521 C>T. Обнаружено, что лица с сочетанием генотипов 704ТТ и 521TT имеют значительно повышенный уровень ангиотензиногена в плазме [17], что может привести к нарушениям физиологии спиральных маточных артерий в I триместре беременности и таким образом способствовать нарушению маточно-плацентарного кровотока и развитию СЗРП [18].

Из маркеров эндотелиальной дисфункции в модель включен полиморфизм NOS3 894 G>T, где для аллеля 894 Т получен протективный эффект. Эндотелиальная синтаза оксида азота представляет собой фермент клеток эндотелиоцитов и кардиомиоцитов, синтезирующий оксид азота. Фермент кодируется геном NOS3. Наличие аллеля T в генотипе помогает лучше отвечать на физические тренировки. Кроме того, оксид азота представляет собой мощный сосудорасширяющий агент, вырабатывающийся в ответ на физические нагрузки. У носителей генотипа NOS3 894ТТ улучшены контроль функции скелетных мышц, усвоение глюкозы скелетными мышцами во время тренировки и выработка митохондриями АТФ [19, 20]. У беременных с СЗРП протективный эффект аллеля 894 Т особенно выражен на фоне дефицита макроэргов при активации анаэробного гликолиза и как следствие снижения общей энергетики организма.

Проведенные исследования взаимосвязи генов, влияющих на различные пути патогенеза СЗРП, позволяют более полно оценить наследственный риск формирования данной патологии. Известно, что для мультифакториальных заболеваний характерна существенная генетическая компонента. При этом вклад одного гена в формирование патологического процесса, как правило, невелик, хотя иногда одни и те же генетические варианты оказываются вовлеченными в формирование предрасположенности к различным патологическим состояниям. Установлено, что любой продукт гена реализует свой эффект через множество межгенных взаимодействий (отражающих взаимодействие между белками), поэтому индивидуальный эффект гена, эффект единичной мутации или замены может быть оценен наиболее корректно только в контексте этих генных (метаболических) сетей [21].

Исходя из сказанного, мультигенный анализ для оценки наследственной предрасположенности в развитии многофакторной патологии представляется более перспективным, чем оценка роли отдельно взятой нуклеотидной замены. Применяя подобные модели анализа ген-генных взаимодействий, можно использовать широкий спектр полиморфных вариантов генов для прогнозирования индивидуальной предрасположенности к акушерско-гинекологической патологии на любом этапе консультирования женщины. Для этого необходимо провести исследования на достаточно большой, но локальной выборке для получения статистически значимых данных, которые можно будет экстраполировать на генеральную популяцию. Необходимо учитывать, что статистически значимые ассоциации обнаружены у женщин Свердловской области, и результаты могут не экстраполироваться на другие популяции.

Комплексная оценка генных сетей, влияющих на различные пути патогенеза определенной мультифакториальной патологии, является более перспективной, чем однофакторный анализ. Статистические методы моделирования позволяют более эффективно выявлять ассоциации множества генетических предикторов с определенным патологическим процессом. В проведенном исследовании 26 полиморфизмов генов статистически значимым предиктором синдрома задержки роста плода явилось определенное сочетание генотипов полиморфных генов (PPARA 2498 G>C, PPARGC 1B A203P G>C, MTRR 66 A>G, AGT 704 T>C, AGT 521 T>C, NOS 894 G>T). Использование логистической модели прогноза синдрома задержки роста плода у пациенток с высоким риском формирования этой патологии позволит с ранних сроков гестации проводить профилактику развития плацентарной недостаточности, что в конечном итоге будет способствовать улучшению перинатальных исходов.

Участие авторов:

Концепция и дизайн исследования — Т.Б., Н.В.

Сбор и обработка материала — С.А.

Статистическая обработка — С.А.

Написание текста — Т.Б., Н.С.

Редактирование — Н.В.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

The authors declare no conflict of interest.

Сведения об авторах

Третьякова Т.Б. — e-mail: tbtretyakova@yandex.ru

Демченко Н.С. — e-mail: medichkan@mail.ru; https//orcid.org/0000-0002-5196-2168

Путилова Н.В. — e-mail: putilova-1959@mail.ru

Ажибеков С.А. — e-mail: samat1901@mail.ru

КАК ЦИТИРОВАТЬ:

Третьякова Т.Б., Демченко Н.С., Путилова Н.В., Ажибеков С.А. Анализ межгенных взаимодействий в формировании наследственной предрасположенности к синдрому задержки роста плода. Проблемы репродукции. 2019;25(3):-128. https://doi.org/10.116/repro201925031

Azhibekov S.A. — e-mail: samat1901@mail.ru

Автор, ответственный за переписку: Демченко Н.С. — e-mail: medichkan@mail.ru