Оценка способности сперматозоидов человека к апоптозу после криоконсервации спермы

Криоконсервация донорской спермы часто используется с целью ее хранения для дальнейшего использования при проведении искусственного оплодотворения в процедурах вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Достижения последних лет в лечении онкологических заболеваний приводят к тому, что пациенты успешно завершают лечение, но современные и эффективные схемы противоопухолевой терапии, к сожалению, обладают выраженной гонадотоксичностью. Высокодозная химиотерапия и лучевая терапия практически в 100% случаев приводят к бесплодию. Поэтому для сохранения фертильности сперматозоидов перед проведением химио- и лучевой терапии, а также других видов лечения, связанных с влиянием на сперматогенез, используют криоконсервацию [1].

Криоконсервация является методом заморозки биологического материала при помощи жидкого азота (при температуре –196 °C), который обеспечивает сохранение и жизнеспособность гамет после этапа разморозки [2, 3]. Такая низкая температура способствует приостановлению в половых клетках всех биохимических процессов, что позволяет хранить их длительное время, используя при этом специальную обработку замораживаемого материала криопротекторами — веществами, которые защищают клеточную мембрану и предотвращают чрезмерное охлаждение клеток, их повреждение при снижении температуры и обезвоживание, а также увеличивают вязкость среды, снижая образование кристаллов.

Однако в течение процедуры замораживания и размораживания мужские гаметы подвергаются сильнейшему стрессу, в результате чего может происходить изменение морфологии, уменьшение подвижности и жизнеспособности гамет и снижение способности к оплодотворению [4—6].

Важной и актуальной проблемой в современной репродуктивной медицине, связанной с необходимостью длительного хранения полноценной спермы для применения ее в процедурах ВРТ, таких как экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО) или интрацитоплазматическая инъекция сперматозоида (ИКСИ), является восстановление и определение жизнеспособности и функциональных характеристик сперматозоидов после размораживания спермы [7—9].

Стресс, вызванный криоконсервацией, может привести к нарушению свойств мембраны сперматозоида, состояние которой очень важно для выживания сперматозоида после криоконсервации. Выражением таких биохимических изменений в мембране могут стать, в частности, изменения в динамике липидов [10, 11].

Одним из необходимых условий жизнедеятельности всех клеток, в том числе и половых, является поддержание асимметрии липидов клеточной мембраны: присутствие фосфатидилхолина и сфингомиелина в наружном слое мембраны, а фосфатидилсерина (ФС) — исключительно во внутреннем слое [11].

Одним из самых ранних биохимических изменений, происходящих в мембране клетки, подвергшейся гибели путем апоптоза, являются нарушение асимметрии липидов мембраны и экспрессия ФС на ее внешнюю сторону, детектировать которую возможно при помощи конъюгированного с флюорохромом белка аннексина-V (AnV-FITC), специфически связывающегося с ФС («аннексиновый» метод) [12, 13].

Изменения в клеточной мембране в ходе апоптоза также включают повышение ее проницаемости для небольших молекул, например катионного красителя йодида пропидия (PI). Однако в динамике развития апоптоза потеря мембранной асимметрии соответствует начальным этапам апоптоза (ранний апоптоз) и предшествует потере проницаемости мембраны для PI. На этой стадии апоптотические клетки связывают AnV, но, как и живые клетки, непроницаемы для PI и расцениваются как (AnV+/PI–) — сперматозоиды [14].

Поздняя фаза апоптоза сопровождается не только нарушением мембранной асимметрии, но и резким возрастанием проницаемости мембраны для PI. Клетки, находящиеся в позднем апоптозе, и частично некротические клетки связывают AnV и проницаемы для PI и расцениваются как (AnV+/PI+)-сперматозоиды. Некротические клетки не связывают AnV, но проницаемы для PI, их расценивают как (AnV–/PI+)-сперматозоиды. Живые клетки не связывают AnV и непроницаемы для PI — это (AnV–/PI–)-сперматозоиды [11, 12].

Данные литературы [1, 15, 16] о способности сперматозоидов человека к запуску процесса апоптоза после процедур замораживания/оттаивания и о влиянии криоконсервации на экспрессию ФС, как раннего маркера апоптоза, очень неоднозначны, что диктует необходимость расширения работы в этом направлении [1, 15, 16]. Отечественных работ, посвященных изучению данного вопроса, в доступной литературе не встречалось.

Цель настоящего исследования — оценка способности сперматозоидов человека к апоптозу в ответ на криоконсервацию.

В исследовании использовали эякуляты 38 здоровых фертильных мужчин в возрасте от 22 до 40 лет, давших информативное согласие на проведение исследований. Сбор эякулятов проводился после 72 ч сексуального воздержания и осуществлялся в ГБУ здравоохранения Астраханской области «Центр охраны здоровья семьи и репродукции».

Образцы эякулятов после полного разжижения делили на две части: одна часть являлась контролем (до замораживания), а вторая часть эякулята подвергалась замораживанию и оттаиванию (опыт). До замораживания и сразу после оттаивания образцы эякулятов исследовались на морфофункциональные критерии качества, а также на наличие маркера апоптоза у сперматозоидов — экспрессию ФС [17].

Измерение морфофункциональных показателей спермограммы — концентрации, подвижности, жизнеспособности и морфологии сперматозоидов проводили в соответствии с рекомендациями и нормативами ВОЗ 5-го издания от 2010 г. [18]. Жизнеспособность клеток составила около 80% [19].

Для выявления перемещения ФС на внешнюю сторону мембраны сперматозоидов применяли «аннексиновый» метод, окрашивая AnV-FITC и PI (BD, Biosciences Pharmingen, США) предварительно отмытые клетки, согласно инструкции изготовителя. Мазки исследовали на флюоресцентном микроскопе МИКРОМЕД 3 ЛЮМ (Санкт-Петербург) под иммерсионным объективом ×100 [20, 21].

Замораживание/размораживание проводили по стандартной схеме. Образцы эякулятов хранились в жидком азоте при температуре –196 °C в течение 48—72 ч. В качестве криоконсервантов применяли стерильную среду для замораживания (Sperm Freeze, FertiPro NV, Бельгия), которую используют в практике ВРТ [1, 4, 22].

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием программы EXСEL-2007. Данные представлены в виде М±m. Статистическую значимость различий сравниваемых величин оценивали с помощью t-критерия Стьюдента при значении р<0,05. Для оценки взаимосвязи исследуемых показателей использовали коэффициент корреляции (r) Пирсона.

После криоконсервации эякулятов выявлено уменьшение количества активно подвижных сперматозоидов более чем в 1,5 раза по сравнению с контролем. Восстановление подвижности гамет после криоконсервации — индекс выживания сперматозоидов (в %), который рассчитывался как отношение количества активно подвижных гамет в опыте к количеству активно подвижных гамет в контроле, составил более 50%.

Также выявлено, что после криоконсервации снижалась жизнеспособность половых клеток по сравнению с контролем: после оттаивания эякулятов наблюдалось достоверное (р<0,001) уменьшение количества живых неокрашенных (AnV–/PI–)-сперматозоидов почти в 2 раза, а также живых, находящихся на стадии раннего апоптоза и экспрессирующих ФС на поверхность мембраны (AnV+/PI–)-клеток. Причем основная часть живых (AnV–/PI–)-сперматозоидов после криоконсервации погибает в результате некроза, о чем свидетельствует значительное увеличение доли мертвых, не связывающих AnV-FITC, (AnV–/PI+)-клеток (см. рисунок).

В то же время выявлено увеличение количества окрашивающихся двумя красителями (АnV+/PI+)-сперматозоидов, вступивших в стадию позднего апоптоза.

Был рассчитан индекс апоптоза как отношение количества (AnV+/PI–)-сперматозоидов (в %) в опыте к количеству (AnV+/PI–)-сперматозоидов в контроле, который имел значение меньше 1, что свидетельствует об ингибировании процесса апоптоза у сперматозоидов после криоконсервации.

Поскольку утрата жизнеспособности и гибель мужских половых клеток сопровождаются потерей их подвижности, то из всех критериев качества гамет для выявления взаимосвязи с процентным содержанием жизнеспособных и нежизнеспособных сперматозоидов в эякулятах фертильных мужчин до и после криоконсервации была выбрана подвижность сперматозоидов.

Не выявлено корреляции между процентным содержанием живых и мертвых сперматозоидов в эякулятах до криоконсервации и подвижностью гамет. Однако выявлена положительная корреляция между количеством активно подвижных гамет и количеством живых неокрашенных (AnV–/PI–)-сперматозоидов в эякулятах после оттаивания (r=0,56; р<0,001), а также отрицательная корреляция с количеством (АnV+/PI+)-сперматозоидов, находящихся в позднем апоптозе (r= –0,52; р<0,001).

Восстановление функциональных характеристик сперматозоидов после размораживания спермы зависит не только от начального качества образцов эякулятов, но и от правильного проведения самого процесса замораживания/оттаивания. Определение жизнеспособности мужских половых клеток после криоконсервации, несомненно, является важной проблемой в современной репродуктологии.

В проведенном нами исследовании изучено влияние криоконсервации на состояние сперматозоидов фертильных мужчин и выявлено, что после оттаивания эякулята происходит снижение не только подвижности и жизнеспособности гамет, но и содержания апоптотических сперматозоидов, экспрессирующих ФС на внешнюю сторону мембраны и связывающих AnV.

Выявленное нами после криоконсервации спермы уменьшение процентного содержания ранних апоптотических (AnV+/PI–)-клеток противоречит результатам некоторых исследований, проведенных другими авторами [15, 23], о том, что после процедуры замораживания/оттаивания наряду с уменьшением содержания живых (AnV–/PI–)-сперматозоидов количество (AnV+/PI–)-клеток либо оставалось неизмененным, либо увеличивалось.

Противоречивость результатов можно объяснить использованием различных подходов в исследовании: авторы использовали для криоконсервации не нативный эякулят, а предварительно отделенные от семенной плазмы методом градиентного центрифугирования или методом «swim-up» сперматозоиды. Также для выявления жизнеспособности клеток авторы использовали краситель 6-CFDA, но окраска клеток красителями 6-CFDA и PI является не эквивалентной [24].

Уменьшение количества живых, находящихся в раннем апоптозе (AnV+/PI–)-сперматозоидов и экспрессирующих ФС, произошло, скорее всего, из-за того, что эти гаметы погибли в процессе замораживания/оттаивания и приобрели двойное окрашивание, перейдя в стадию позднего апоптоза, став (АnV+/PI+)-клетками. Однако большая часть живых неокрашенных (AnV–/PI–)-клеток погибает путем некроза и становится (AnV–/PI+)-клетками, без экспрессии Ф.С. Такой переход количества живых (AnV–/PI–)-клеток в некротические (AnV–/PI+)-клетки без экспрессии ФС гораздо больше, чем переход живых окрашенных (AnV+/PI–)-клеток в мертвые (AnV+/PI+)-клетки, экспрессирующие ФС.

Выявленная нами коррелятивная связь между содержанием в эякулятах после криоконсервации поздних апоптотических (AnV+/PI+)-клеток и подвижностью сперматозоидов в соответствии с коэффициентом отрицательной корреляции подтверждает то, что на поздней стадии апоптоза вместе с изменениями в структурно-биохимическом состоянии мембран сперматозоидов, нарушением мембранной асимметрии фосфолипидного слоя и резким возрастанием проницаемости мембраны для катионного красителя PI происходит потеря подвижности гамет. Таким образом, качество спермы после криоконсервации затрагивается на последних стадиях апоптоза.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что применение криоконсервации для хранения спермы не вызывает индукции апоптоза у сперматозоидов фертильных мужчин. Снижение функциональных характеристик и жизнеспособности гамет после процедуры размораживания происходит главным образом из-за некротической гибели клеток.

Определение экспрессии ФС на поверхность половых клеток при помощи AnV-FITC в комбинации с PI может служить в качестве нового маркера для выявления качества гамет с целью дальнейшего использования в программах ВРТ не только свежих сперматозоидов, но и сперматозоидов после криоконсервации, а также может дать дополнительную информацию при изучении влияния криоконсервации на жизнеспособность сперматозоидов для прогнозирования результатов криоконсервирования спермы.

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Дата подачи рукописи: 16.03.17.