Наиболее сложным периодом беременности, определяющим ее течение и исход, является I триместр, который включает основные критические периоды: имплантацию, органогенез и плацентацию [1-3]. Этап формирования маточно-плацентарной области эндометрия и плацентации плодного яйца объединяет васкуляризацию ворсин хориона и их инвазию в децидуальные сосуды эндометрия [4, 5]. Трофобласт проникает в уже децидуализированную строму эндометрия и прорастает в материнские кровеносные сосуды. Продукция эндотелиальных факторов во многом определяет процессы ангиогенеза, инвазии трофобласта, ремоделирования спиральных артерий с образованием маточно-плацентарных сосудов [6].

В пролиферации клеточных компонентов эндотелия сосудов эндометрия и хориона основную роль играют ангиогенные факторы роста. Тканевая гипоксия является ключевым условием полноценной инвазии трофобласта. Доказана роль гипоксии в активации процессов ангиогенеза посредством индукции гипоксия-индуцирующего фактора 1α (HIF-1α). Последний является генным промотором, обеспечивающим транскрипцию мРНК сосудисто-эндотелиального фактора роста (VEGF-A). Таким образом, тканевая гипоксия индуцирует экспрессию VEGF в эндометрии [5, 7].

VEGF является чрезвычайно специфичным митогеном эндотелиальных клеток, который стимулирует эндотелиальную пролиферацию, миграцию клеток и замедляет апоптоз клеток хориона и децидуальной ткани [8]. Среди белков семейства VEGF фактор роста VEGF-А является самым мощным проангиогенным протеином и играет ключевую роль в регуляции ангиогенеза. В эндотелии больших и малых сосудов обнаружены высокоаффинные рецепторы VEGF, что подтверждает гипотезу о сосудистом эндотелии как основной мишени действия данного регуляторного пептида. Фактор роста VEGF-A в эндотелии сосудов отвечает за два основных события: увеличение проницаемости сосудов и пролиферацию эндотелиальных клеток, оба события необходимы для успешного развития эмбриона [9]. Доказано, что тканевая гипоксия, связанная с ингибированием активности кровотока в эндометрии в период «окна имплантации», увеличивает синтез ангиогенных факторов роста, таких как VEGF-A и ангиопоэтина-2 в эндотелиальных клетках эндометрия, в то время как синтез ангиопоэтина-1 в клетках уменьшается [7, 9, 10].

Замена аминокислот в нуклеотидной последовательности гена VEGF-A может привести к изменению экспрессии гена и, как следствие, к снижению или, наоборот, к неадекватному повышению уровня VEGF-A.

Способность эмбриональных тканей адекватно интегрироваться в материнские эндометриальные клетки критична для периода инвазии трофобласта. Она позволяет эмбриону получить доступ к стабильному кровоснабжению на оставшийся период беременности. Любые нарушения регуляции данных процессов могут повлечь за собой неполноценную имплантацию и инвазию трофобласта с исходом в неразвивающуюся беременность.

Цель исследования - изучение молекулярно-генетических механизмов регуляции ангиогенеза, фенотипических особенностей гравидарной трансформации эндометрия и инвазии трофобласта у пациенток с неразвивающейся беременностью.

Обследованы 116 женщин с неразвивающейся беременностью в сроке до 12 нед гестации (7,5±1,8 нед). Контрольная группа была представлена 116 женщинами с физиологически протекающей беременностью, принявших решение о медицинском аборте в сроке до 12 нед (8,3 нед±4,1 дня). Клинический диагноз неразвивающейся беременности был поставлен на основании динамического ультразвукового обследования. Средний возраст пациенток в основной группе составил от 21 года до 44 лет (32,5±5,6 года), в контрольной группе - 24-43 года (33,4±3,8 года) (р>0,05). Группы сопоставимы по возрасту.

Поскольку в формировании плаценты участвуют ткани матери (эндометрий) и плода (хорион), для установления ассоциации полиморфизмов генов регуляции ангиогенеза с риском неразвивающейся беременности проводился анализ аллельных полиморфизмов гена VEGF-А женщин и их эмбриональных тканей, полученных в результате вакуум-аспирации плодного яйца из полости матки.

Изучены полиморфизмы генов регуляции ангиогенеза VEGF-А 936C>T, VEGF-А 634G>C. Для генотипирования исследовали венозную кровь. ДНК выделяли с помощью реагентов Проба ГС-Генетика (ООО «НПО ДНК-Технология») из 0,5 мл крови, взятой в пробирку с ЭДТА в качестве антикоагулянта. Для оценки количества выделенной геномной ДНК использовали набор реагентов КВМ для метода полимеразной цепной реакции - ПЦР (НПО «ДНК-Технология», Россия). Генотипирование образцов по аллельным вариантам исследуемых генов проводили методом аллельспецифичной ПЦР в режиме реального времени со снятием кривых плавления продуктов амплификации. Анализ результатов ПЦР проводили в автоматическом режиме программного обеспечения детектирующего амплификатора ДТ-96 (НПО «ДНК-Технология», Россия).

Для гистологического исследования был взят материал ворсин хориона, ткани эндометрия, элементы плодного пузыря. Биологический материал фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина в течение суток, затем проводилась спиртовая проводка. После заливки в парафин готовили срезы толщиной 5-6 мкм и окрашивали их гематоксилином и эозином. Микроскопическое исследование проводили на микроскопе CarlZeissPrimoStar. При морфологическом исследовании биологического материала проводили анализ двух компонентов: децидуальной ткани маточно-плацентарной области и ворсин незрелой плаценты (хориона).

Для анализа возможной ассоциации аллельных полиморфизмов гена VEGF-А с нарушением формирования сосудов в ворсинах хориона на следующем этапе анализа основная группа была разделена на две подгруппы по степени васкуляризации ворсин хориона. Подгруппу, А составили случаи неразвивающейся беременности, при которых по результатам морфологического исследования продуктов зачатия выявлена гиповаскуляризация или аваскуляризация ворсин хориона.

Подгруппу Б составили случаи неразвивающейся беременности, при которых по результатам морфологического исследования абортного материала выявлена адекватная васкуляризация ворсин хориона.

Статистический анализ данных осуществлялся с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Результаты обрабатывались методами вариационной статистики и представлены в виде M±m. Оценка достоверности различий средних величин и относительных показателей проводилась с использованием t-критерия (критерия Стьюдента). За уровень значимости в исследовании принято p<0,05. Различия между непараметрическими переменными проводились при помощи χ² Пирсона (Person). Относительный риск оценивали по показателю соотношения шансов (odds ratio, OR) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05.

Тест на соответствие распределения генотипов закону Харди-Вайнберга в обеих выборках проводили с помощью критерия χ² с использованием программы Hardy-Weinbergequilibrium.

Результаты генотипирования аллельных вариантов генов VEGF-А 936 C>T и VEGF-А 634 G>C у женщин и их эмбриональных тканей не обнаружили значимых различий по частоте встречаемости генотипов в группах наблюдения (табл. 1).

Проанализированы частоты полиморфных вариантов гена VEGF-А в локусах 936 C>T и 634 G>C у женщин, имеющих по данным морфологического исследования гиповаскуляризацию или аваскуляризацию ворсин хориона, и их эмбриональных тканях (табл. 2).

При исследовании доминантной модели генотипа VEGF-A у женщин с неразвивающейся беременностью, имеющих сниженную васкуляризацию ворсин хориона, достоверно чаще определяется генотип, содержащий аллель VEGF-A 634С (OR=1,7, CI 95% 0,93-3,11; p=0,04) (см. табл. 2). По результатам аллельного генотипирования вариантов гена VEGF-А 936 C>T и VEGF-А 634 G>C среди эмбрионов достоверных различий между группами не выявлено.

Результаты совместного аллельного генотипирования системы мать-плод у женщин с неразвивающейся беременностью показали достоверно более высокую частоту генотипов с полиморфным аллелем 936 Т гена VEGF-A (OR=1,61, CI 95% 1,04-2,48; p=0,03) (табл. 3).

Морфологические критерии диагностики эндометриальной и плацентарной недостаточности при неразвивающейся беременности позволили проанализировать степень развития сосудов ворсин хориона, инвазии трофобласта и гравидарной трансформации децидуальной ткани при физиологически протекающей и неразвивающейся беременности.

Оценивая характер формирования маточно-плацентарной области, следует отметить, что в материале преобладали клетки децидуальной ткани с элементами цитолиза. Это сопровождалось слабой (43%) или умеренной (30%) инвазией трофобласта с резким отставанием (42%) или отсутствием (11%) гравидарной перестройки артерий эндометрия (табл. 4).

Эпителий децидуальной ткани чаще был с признаками выраженной дистрофии (55%) с субэпителиальным отеком, атрофией клеток (см. табл. 4). В 50% случаев наблюдался очаговый тип инфильтрации и в 44% рассеянный тип. В 26% случаев отмечался смешанный характер инфильтрации - рассеянные лимфоцитарные инфильтраты с нейтрофильными элементами.

При исследовании состояния децидуальной ткани наблюдались различные по степени выраженности признаки дистрофии и деструкции: поля гиалиноза, выпадения фибрина, ядерного распада, некроза. В преобладающем количестве случаев железы эндометрия были без гравидарной перестройки, в ряде случаев с перигландулярной лимфогистиоцитарной инфильтрацией (рис. 1).

Во всех препаратах обнаруживались расширенные просветы желез с реакцией Ариас-Стеллы и в отдельных случаях железы пилообразной формы с реакцией Овербека в качестве типичного признака регрессирующей беременности.

Анализ результатов патоморфологического исследования продуктов зачатия в условиях беременности показал, что при сроке остановки развития плода 4-11,5 (7,5±1,8) нед в материале хориона обнаруживались эмбриональные ворсины разной степени зрелости с преобладанием незрелых ворсин промежуточного типа. В подавляющем проценте случаев (80%) структура стромы ворсин была незрелая (табл. 5).

В материале преобладали ворсины разной степени зрелости с преобладанием незрелых ворсин промежуточного типа. Ворсины с единичными тонкостенными сосудами составили 25%, без сосудов - 63%. Лишь в отдельных случаях (12%) сосуды в ворсинах хориона были сформированы полностью в соответствии со сроком гестации (см. табл. 5).

Анализ состояния ворсинчатого дерева обнаружил значительные структурные повреждения хориального эпителия. Эпителий ворсин отличался участками резкого истончения и уплощения, часто был представлен слоем только синцитиотрофобласта. В ряде случаев трофобласт был двухслойным, присутствовал цитотрофобласт и синцитиотрофобласт, чаще со слабыми признаками пролиферации. Базальная мембрана эпителия трофобласта была подвержена деструкции, отеку, фибриноидной дистрофии.

В строме ворсин наблюдались различные по степени выраженности признаки деструкции: резкий отек межуточного вещества, гидропическая дистрофия клеток стромы, гиалиноз, отложения фибриноида, ослизнение, очаги некроза и аутолиза. Волокнистые структуры стромы ворсин дезорганизованы, исчезают клеточные элементы, которые замещают поля клеточного детрита. Строма склерозирована, в ряде случаев ворсины без стромы. На периферии ворсин встречались единичные макрофаги и фибробласты (рис. 2).

Для оценки суммарных взаимодействий компонентов системы мать-плацента-плод при неразвивающейся беременности и их влияния на гибель плода были подвергнуты анализу следующие морфологические признаки: выраженность гравидарной трансформации сосудов эндометрия, степень развития и васкуляризации ворсин хориона, полноценность инвазии трофобласта. Результаты представлены на рис. 3.

При анализе сочетания гравидарной перестройки артерий со степенью инвазии трофобласта выявлено, что полноценная имплантация плодного яйца наблюдалась только в 21% случаев. В 51% случаев была выявлена неполноценная инвазия трофобласта в сочетании с неполной гравидарной трансформацией сосудов эндометрия. В 23% наблюдений на фоне нормально сформированных сосудов эндометрия инвазия хориона была недостаточной. Таким образом, в сумме у 79% пациенток с неразвивающейся беременностью имелись морфологические предпосылки, связанные с аномальным развитием системы маточно-хориального кровоснабжения.

Этап формирования маточно-плацентарной области эндометрия и плацентации плодного яйца представляет собой критический период гестации и определяет дальнейший ход течения беременности. Он включает васкуляризацию ворсин хориона и их инвазию в децидуальные сосуды [5, 11].

В работах последних лет [6, 12, 13] доказано, что нарушения фетоплацентарного кровообращения инициируются уже на ранних стадиях эмбриогенеза и являются следствием нарушений плацентации и инвазии трофобласта. Сосудисто-эндотелиальный фактор роста VEGF-А отвечает за эндометриальный ангиогенез, гравидарное ремоделирование сосудов и формирование трофобласта [14]. Наличие в генотипе полиморфных вариантов 936 C>T и -634 G>C гена VEGF-A, кодирующего синтез фактора роста VEGF-А, может способствовать нарушению формирования плацентарного комплекса при неразвивающейся беременности. Так как аллельные варианты гена VEGF-А могут влиять на уровень синтеза VEGF-А в тканях беременной и плода.

Нарушение синтеза VEGF-А в качестве регуляторного фактора формирования маточно-плацентарной области и нарушения генетической программы развития плода определяет степень морфологических изменений, наблюдаемых при гистологическом исследовании в децидуальной ткани маточно-плацентарной области и в ворсинах незрелой плаценты (хорионе) в случаях неразвивающейся беременности [15, 16].

В нашем исследовании установлено, что в группе женщин и их эмбрионов с замершей беременностью достоверно чаще встречались генотипы с полиморфным аллелем 936 Т гена VEGF-A. Следовательно, можно предположить, что полиморфные генотипы 936СТ и 939ТТ гена VEGF-А могут предрасполагать к сниженной продукции фактора роста VEGF-А в эндометрии и хорионе и послужить одной из причин нарушения инвазии и имплантации трофобласта, следовательно, и гибели плода при неразвивающейся беременности.

Интересным представлялось изучение ассоциации носительства полиморфных аллелей генов VEGF-А с особенностями патоморфологических изменений системы мать-плацента-плод. По результатам собственных исследований, среди женщин с неразвивающейся беременностью и разной степенью нарушения васкуляризации хориона (подгруппа А) достоверно чаще определялось носительство полиморфного аллеля 634С. Таким образом, полиморфные варианты гена VEGF-А 634CC и VEGF-A 634GC могут влиять на сниженную продукцию фактора роста VEGF-А при неразвивающейся беременности.

Результатом гравидарной трансформации эндометрия и инвазии трофобласта является формирование плодово-плацентарного кровообращения, которое обеспечивает газообмен и транспорт питательных веществ в системе мать-плацента-плод, что является критическим фактором для дальнейшего роста эмбриона. В нашем исследовании показано, что плодово-плацентарное кровообращение было сформировано адекватно гестационному возрасту плода только в 21% случаев.

Таким образом, генетически-детерминированное недоразвитие системы кровообращения маточно-плацентарной зоны эндометрия может играть ключевую роль в нарушении процессов имплантации и первой волны инвазии трофобласта при неразвивающейся беременности.

Конфликт интересов отсутствует.