Оценка состояния зрелости эмбрионов перед переносом в полость матки является абсолютно необходимым этапом программы ЭКО/ИКСИ. Однако низкая эффективность лечения больных бесплодием с использованием методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) требует как разработки методов контроля всех технологических этапов ЭКО/ИКСИ, так и решения принципиальных фундаментальных вопросов для повышения результативности ВРТ. К числу таких новых направлений следует отнести оценку взаимодействия лиганд-рецепторных систем между матерью и эмбрионом до стадии имплантации, поскольку при физиологических условиях это выполняется, а при проведении ЭКО/ИКСИ нет [1]. Коммуникации между клеточными структурами развивающегося эмбриона (клеточный кластер эмбриона) и клеточными структурами материнского трактата (клеточный кластер матери) являются важными на ранней стадии его развития во время передвижения через маточную трубу в полость матки. Это связано с тем, что LIF (лейкемияингибирующий фактор) и его рецептор LIFR экспрессируются клетками как в маточных трубах, эндометрии, так и в человеческом эмбрионе [4, 15]. Известно, что гликопротеин 130 (gp130), как часть системы LIF/LIFR, присутствует в эмбрионах человека на стадии бластоцисты во внутренней массе клеток (ICM) [15]. Этот гликопротеин осуществляет коммуникацию между клетками трофактодермы бластоцисты и клеточными структурами материнского трактата на более поздних стадиях развития эмбриона, но не на более ранних стадиях во время транспорта и развития в маточных трубах. Показано, что gp130 необходим для развития эмбриона у мышей [13].

Данных об активации сигнального пути для gp130 у эмбриона человека не установлено, однако показано, что gp130 в отличие от LIF и LIFR является более значимым для развития эмбриона перед его имплантацией. Добавление gp130 в культуральную среду способствует более активному развитию эмбриона до стадии бластоцисты. Следовательно, естественная окружающая среда (в том числе поверхностный эпителий маточных труб), с которой контактирует эмбрион человека на ранних стадиях развития, и эндометрий на более поздних стадиях являются необходимым условием формирования полноценного и жизнеспособного эмбриона. Все это свидетельствует о паракринных механизмах взаимодействия эмбриона и тканей репродуктивного трактата [10].

Научные данные о содержании растворимых LIF, LIFR, gp130 в среде 3-го и 5-го дней культивирования эмбрионов в программах ЭКО/ИКСИ в литературе отсутствуют.

Цель исследования — провести сравнительный анализ содержания растворимых LIF, LIFR, gp130 в среде 3-го и 5-го дней культивирования эмбрионов в программах ЭКО/ИКСИ для оценки активации сигнального пути LIF/LIFR/gp130 и повышения эффективности лечения бесплодия.

Под наблюдением находились 36 женщин репродуктивного возраста (от 20 до 37 лет, средний 31,7±3,4 года) с бесплодием. После проведения ЭКО/ИКСИ у 20 женщин наступила беременность и у 16 — беременность не наступила. Подбор и рандомизация больных осуществлялись совместно с д.м.н., проф. Л.Н. Кузьмичевым и к.м.н. Н.С. Щетининой. Клиническая характеристика больных была представлена нами ранее [3]. Исследование одобрено этическим комитетом ФГБУ «НЦАГиП им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России.

Критерии включения: женщины с нормальным менструальным циклом (28—32 дня), нормальным содержанием в сыворотке крови ЛГ, ФСГ, пролактина, эстрадиола, прогестерона, тестостерона, с наличием хотя бы одного эмбриона для переноса. Всем женщинам, включенным в данное исследование, были полностью разъяснены все аспекты лечения и необходимого обследования. От всех женщин получено информированное согласие на участие в исследовании.

Критерии исключения: наличие у женщин синдрома поликистозных яичников, патологии эндометрия, гидросальпинкса по данным ультразвукового исследования и гистеросальпингографии, астенотератозооспермия III и IV степени у мужа. Пациентки с неудовлетворительной морфологической оценкой эмбрионов также были исключены из дальнейшего наблюдения.

Дизайн исследования. Одномоментное исследование, стратифицированная рандомизация. Определение достаточности выборки осуществлялось исходя из необходимого и достигаемого в ходе исследования уровня достоверности (р<0,05).

Стимуляция овуляции. Всем женщинам проводилась стимуляция по длинному протоколу, как было описано нами ранее [2].

Качество эмбрионов оценивали перед каждым переносом. Перенос осуществлялся на 3-й или 5-й день культивирования после трансвагинальной пункции яичников (ТВПЯ), как было описано нами ранее [2].

При выборе дня переноса учитывалось общее состояние больной (симптомы гиперстимуляции яичников) и эмбриологические характеристики (число эмбрионов на 3-и и 5-е сутки культивирования). Эмбрионами хорошего качества считались эмбрионы: на 2-е сутки развития, достигшие стадии 4 бластомеров и более (48 ч после ТВПЯ), на 3-е сутки — 6 бластомеров и более. Дробящиеся эмбрионы хорошего качества имели не более 10% фрагментации. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты, оценивались согласно классификации D. Gardner [8]. Эмбрионами удовлетворительной морфологической оценки считались 4AA, 4AB, 4BA, 5AA, 5AB, 5BA. Эмбрионы переносили в полость матки под контролем трансабдоминального ультразвука (Logic 200) c помощью катетеров Wallace («Smiths Medical International Ltd.», Великобритания) или Cook-K-Jet («Сook Ireland Ltd.», Ирландия).

Диагностика и наблюдение беременности. Биохимический тест на беременность (β-хорионический гонадотропин человека) проводили на 14—16-й день, а ультразвуковую диагностику беременности осуществляли на 21-й день после переноса эмбрионов, как было описано нами ранее [1].

Иммуноферментный анализ. Анализ содержания LIF (в пг/мл) (human LIF Quantikine ELISA kit, DLF00, R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Великобритания), LIFR в нг/мл (human sLIFR/gp190, Bender MedSystems GmbH), sgp130 нг/мл (human sgp 130 Quantikine ELISA kit, DGP00, R&D Systems Europe Ltd., Abingdon, Великобритания) в культуральной среде Cleavage medium K-SICM-20 на 3-й день и в культуральной среде Blastocyst medium K-SIBM-20 на 5-й день после ТВПЯ проводили с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) и стандартных наборов. Внутренний коэффициент вариабельности (intra-assay CV) составил для LIF, sLIFR/gp190 и sgp130 соответственно 2,36, 4,3 и 4,83%, внутренний коэффициент вариабельности между различными измерениями (inter-assay CV) — соответственно 6,1, 6,2 и 4,1%. Чувствительность метода составляла для LIF 8 пг/мл, для sLIFR/gp190 и sgp130 — соответственно 0,05 и 0,05 нг/мл. Для оценки интенсивности окрашивания при проведении ИФА использовали Biochrom Asys Expert Plus Microplate Reader (Expert Plus v1.5, Asys). Хранение образцов, постановку реакций и расчет результатов осуществляли в стандартных условиях и согласно рекомендациям производителя. После получения аликвоты исследуемого образца к ней добавлялся витализирующий реагент, разработанный совместно с Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University (Уппсала, Швеция), и только после этого проводился ИФА по стандартному протоколу. Расчет содержания LIF, LIFR, gp130 в культуральной среде осуществлялся исходя из числа эмбрионов.

Статистический анализ. Анализ результатов выполняли с помощью статистической компьютерной программы PASW Statistics 18. Достоверность различий полученных результатов проверялась с использованием непараметрического анализа Манна—Уитни, χ²-критерия, ANOVA. Результаты исследования представлены как средние ± стандартное отклонение (М±SD). Различия между группами считались достоверными при р<0,05.

Характеристика обследованных больных. Все включенные в исследование больные (n=36) были разделены на две группы в зависимости от дня инкубирования эмбрионов: 3-й день (1-я группа) и 5-й день (2-я группа). В каждой из групп были выделены две подгруппы в зависимости от наступления беременности по данным биохимического теста на беременность и УЗИ: с наступившей беременностью — 20 больных (в 1-й группе — 14 больных; во 2-й группе — 6) и с ненаступившей беременностью — 16 больных (в 1-й группе — 11; во 2-й группе — 5). Средний возраст пациенток достоверно не различался и составил в 1-й группе 31,1±4,6 года, во 2-й группе — 32,8±3,6 года; длительность бесплодия — 6,6±5,0 и 8,6±4,6 года соответственно. В 1-й группе количество пациенток с диагнозом бесплодия трубного происхождения составило 71,4%, во 2-й группе — 81,8%. Сочетание мужского и трубного факторов бесплодия имело место в 28,6 и 18,2% случаев соответственно. Отсутствие беременности в анамнезе зарегистрировано у 64,3% пациенток 1-й группы и у 54,5% пациенток 2-й группы. Количество больных с пролиферативными заболеваниями (полип эндометрия, гиперплазия эндометрия, эндометриоз, аденомиоз, миома) в 1-й и 2-й группах составило 35,7 и 54,5% соответственно, с воспалительными гинекологическими заболеваниями — 50 и 72,7% соответственно.

Оплодотворение методом ЭКО в 1-й группе проведено в 44% случаев, во 2-й — в 45,5% (р>0,05). ИКСИ использовано в 1-й группе в 56% случаев, во 2-й — в 54,5% (р>0,05). Показанием для ИКСИ была патозооспермия: в 1-й группе в 53,4% случаев, а во 2-й группе — в 21,3% случаев (р>0,05). Количество ооцитов, полученных в ходе ТВПЯ, в 1-й группе достоверно не различалось от их числа во 2-й.

Число переносимых в полость матки эмбрионов в 1-й и 2-й группах варьировало от 1 до 2 при толщине эндометрия 10,4±1,2 и 9,6±1,3 мм соответственно.

На основании анализа клинических данных показано отсутствие статистически значимых достоверных различий между группами по возрасту больных, особенностям репродуктивного анамнеза, фактору и длительности бесплодия, наличию в анамнезе беременностей, пролиферативных и воспалительных гинекологических заболеваний.

I этап. Результаты исследования содержания LIF, LIFR, gp130 в культуральной среде эмбрионов на 3-й и 5-й дни проведения ЭКО/ИКСИ в зависимости от наступления или ненаступления беременности представлены в таблице.

На 3-й день инкубирования эмбрионов содержание LIF в культуральной среде было статистически достоверно ниже, чем на 5-й день культивирования. Однако в этот период различий в содержании LIF в подгруппах с наступившей и ненаступившей беременностью не установлено. На 5-й день инкубирования содержание LIF было статистически достоверно выше по сравнению с таковым на 3-й день инкубирования, и наибольшие значения получены в подгруппе с ненаступившей беременностью.

Результаты определения содержания LIFR/gp190 в изученных группах были аналогичными по отношению к LIF. Однако следует учитывать особенности измерения концентрации LIF и LIFR/gp190: LIF — в пг/мл, а LIFR/gp190 — в нг/мл. Эти различия в концентрации весьма существенны и свидетельствуют о переизбытке LIF в культуральной среде у эмбрионов 5-го дня развития у женщин с ненаступившей беременностью.

На 3-й день инкубирования эмбрионов содержание gp130 было статистически достоверно повышено в подгруппе больных с наступившей беременностью. На 5-й день инкубирования содержание gp130 было статистически достоверно выше по отношению к таковому на 3-й день инкубирования в подгруппе с наступившей беременностью и снижено в подгруппе с ненаступившей беременностью.

Следовательно, наиболее выраженные статистические различия установлены для содержания gp130 в культуральной среде эмбрионов. Показано, что отсутствие накопления gp130 в культуральной среде сочетается с ненаступлением беременности. Эти результаты исследований подтверждают F. Hambiliki и соавт. [10], показавших, что добавление в культуральную среду эмбрионов gp130 улучшило формирование эмбриона до стадии бластоцисты в 73% случаев в сравнении с 43% без добавления gp130. За счет активации сигнального пути LIF/LIFR/gp130 эмбрионы не только солюбилизируют в культуральную среду gp130, но достигают необходимого состояния для имплантации. Оценка содержания LIF и LIFR/gp190 в культуральной среде эмбрионов по отношению к gp130 имеет иное значение. Так, отсутствие изменений содержания LIF и LIFR/gp190 на 3-й день культивирования у больных с наступившей и ненаступившей беременностью указывает на отсутствие активации этого сигнального пути, но в случае его чрезмерной активации на 5-й день культивирования приводит к ненаступлению беременности. Этот регулирующий механизм, несомненно, связан с эффектом концентрации LIF и подтверждает данные F. Hambiliki и соавт. [10] о том, что LIF замедляет развитие эмбриона.

II этап: ROC-анализ. В связи с получением достоверных различий в содержании gp130 при инкубировании эмбрионов на 3-й и 5-й дни был проведен ROC-анализ и получена цифровая оценка ROC-кривых. Показатель площади под ROC-кривой (AUC) при проведении ЭКО/ИКСИ на 3-й день инкубирования эмбрионов для gp130 составил 0,7724±0,221 (р<0,05), что свидетельствует о хорошем качестве полученных моделей для прогнозирования наступления беременности в зависимости от уровня gp130. При сравнении показателей площади под ROC-кривой (AUC) при проведении ЭКО/ИКСИ на 5-й день инкубирования эмбрионов для LIF установлена их однородность с максимальным значением 0,851±0,124 (р<0,05) для LIF, что свидетельствовало об очень хорошем качестве полученной модели. Приведенные характеристики ROC-кривых доказывают важную прогностическую значимость для развития эмбриона уровня gp130 и LIF в культуральной среде, показатели которых могут быть использованы в дополнение к существующим шкалам оценки качества эмбрионов при проведении селективного переноса одного эмбриона в полость матки.

Жизнеспособность эмбриона при культивировании in vitro может быть обеспечена за счет температуры, рН, осмолярности, параметров газовой среды и ряда других параметров. Однако in vitro отсутствует взаимодействие клеточных структур эмбриона и тканевых структур матери. Следовательно, активация или ингибиция сигнальных путей эмбриона могут быть причинами многих безуспешных попыток наступления беременности в программах ЭКО/ИКСИ.

Проведенные нами предварительные исследования по оценке таких взаимодействий на примере прогностической и диагностической значимости определения содержания селектинов в среде эмбрионов 3-го и 5-го дней культивирования, в сыворотке крови, в эндометрии и селективного лиганда МЕCА-79 в эндометрии в период «окна имплантации» позволили показать участие этой системы факторов в процессах наступления беременности. Реальным резервом повышения эффективности программы ЭКО/ИКСИ является на этапе культивирования эмбрионов анализ содержания L-селектина в культуральной среде эмбрионов и отбор эмбрионов для переноса в полость матки на 3-й день культивирования с низким уровнем L-селектина, а на 5-й день с высоким содержанием L-селектина. Эти результаты устанавливали роль активации сигнального пути синтеза L-селектина у эмбрионов в зависимости от длительности культивирования. Возможно, что для полноценной активации необходимо было взаимодействие клеточного кластера эмбрионов с клеточным кластером матери.

Для оценки состояния клеточного кластера матери был проведен иммуногистохимический анализ эутопического эндометрия в период «окна имплантации». Показано, что при высокой экспрессии L-селектина в строме эндометрия и низкой экспрессии специфического лиганда МЕCА-79 в поверхностном эпителии и эпителии желез целесообразно проведение прегравидарной подготовки эндометрия перед программой ЭКО/ИКСИ. Дополнительным прогностическим критерием оценки состояния женщины перед программой ЭКО/ИКСИ является определение содержания L-селектина в крови в период «окна имплантации», и при уровне L-селектина более 1710 нг/мл целесообразно дополнительное проведение иммуногистохимического анализа эндометрия (L-селектина и лиганда МЕCА-79) или прегравидарной подготовки эндометрия перед программой ЭКО/ИКСИ [1].

Известно, что рецепторы для LIF (LIFR) и gp130 присутствуют в маточных трубах и в эндометрии [4, 12, 15]. Гликопротеин gp130 секретируется эндометрием в период имплантации эмбриона [14], а экспрессия регулируется эстрогенами и прогестероном [7]. Изменения в содержании gp130 были показаны при бесплодии [4, 7]. Добавление в культуральную среду gp130 для культивирования эмбрионов увеличивало число эмбрионов, которые развивались до стадии бластоцисты. Эти результаты указывают на то, что gp130 необходим для развития эмбриона и должен быть включен в культуральную среду при культивировании эмбрионов [10]. Известно, что Acyl-CoA binding protein (ACBP) был также активирован в группе эмбрионов с добавлением gp130 в культуральную среду. Это согласуется с данными о том, что у ACBP-нуль мышей гомозиготные эмбрионы не развиваются вне стадии морулы, тогда как дикий тип ACBP и гетерозиготные эмбрионы были жизнеспособны, что указывает на важность ACBP для развития эмбриона [11].

Дополнительное включение gp130 в культуральную среду улучшило формирование эмбриона до стадии бластоцисты в 73% случаев по отношению к 43% без добавления gp130. В то же время добавление LIF в культуральную среду не улучшало развитие эмбриона. По мнению авторов [10], LIF оказывает на эмбрион противоположное действие в сравнении с gp130. Так, если gp130 усиливает развитие эмбриона, то LIF замедляет это развитие. Авторам [8] не удалось объяснить плохое развитие эмбриона в этой группе. В то же время у мышей LIF увеличивает формирование бластоцисты и коэффициенты рождаемости.

Можно полагать, что в отличие от LIF положительный эффект gp130 проявляется через действие других цитокинов, таких как IL-6 или IL-11, поскольку gp130 также действует как рецептор для других цитокинов в семействе IL-6, которые могут иметь влияние на развитие эмбриона [5, 6, 9].

Полученные нами результаты позволили выделить варианты активации сигнального пути LIF/LIFR/gp130 у эмбриона человека в зависимости от воздействия на него тканевого или эмбрионального кластера клеток (см. схему). Так, совокупное воздействие тканевого (яичник, маточные трубы, матка, эндометрий) и эмбрионального кластеров клеток в естественном менструальном цикле приводит к активации у эмбриона сигнального пути LIF/LIFR/gp130 и наступлению беременности. В то же время эмбриональный кластер клеток при проведении ЭКО/ИКСИ осуществляет взаимодействие с кластером клеток яичника и не взаимодействует с кластером клеток маточных труб, маткой и эндометрием. Эти особенности проведения ЭКО/ИКСИ на 3-й или 5-й день культивирования эмбриона приводят либо к активизации у него сигнального пути LIF/LIFR/gp130 и наступлению беременности, либо к снижению активации эмбрионом сигнального пути LIF/LIFR/gp130 и ненаступлению беременности. Мы понимаем, что представленная схема не может отразить все варианты тканевых кластерных взаимодействий между эмбрионом и тканью матери, но начало понимания этих вариантов позволяет надеяться на продолжение исследований. Эти данные не противоречат теории «тихих» эмбрионов 3-го дня инкубации, а дополняют ее данными о временной и стадийной активации сигнального пути LIF/LIFR/gp130 до стадии бластоцисты и достижении ими уровня жизнеспособности, необходимого для наступления беременности [1].

Таким образом, первое сравнительное исследование по активации у эмбрионов 3-го и 5-го дней культивирования сигнального пути LIF/LIFR/gp130 показало, что эти данные могут служить дополнительными диагностическими признаками их жизнеспособности и функциональной активности. Возможность контролировать активацию сигнального пути LIF/LIFR/gp130 у эмбрионов открывает дополнительные возможности дозированного включения в состав среды культивирования необходимых индукторов для повышения качества эмбрионов и является новым направлением в создании системы контролируемого развития эмбрионов перед переносом их в полость матки. Дальнейшие исследования в этом направлении, несомненно, принесут не только новые знания, но и новые технологии для повышения клинической эффективности метода ЭКО/ИКСИ.

Благодарности. Выражаем благодарность professor Matts Olovsson и ass. professor Anneli Stavreus-Evers, сотрудникам Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Уппсала, Швеция, за участие в обсуждениях и поддержку. Финансовая, научная, правовая и политическая помощь осуществлялась Шведской королевской академией наук, Шведским медицинским исследовательским советом (проект № 8683), Университетом Уппсалы, Швеция, Российской академией наук, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России и Минздравом России.