Среди многих причин нарушения фертильности большую роль играет снижение имплантационных свойств эндометрия. Для осуществления успешной имплантации бластоцисты необходима не только нормальная анатомическая структура эндометрия, но и его функциональная состоятельность - адекватная восприимчивость в период «имплантационного окна». Имплантация во многом зависит и от качества эмбриона. Нарушение этой связи наблюдается при различных заболеваниях, например при эндометриозе, синдроме поликистозных яичников, патологии маточных труб, а также при нарушении рецептивности эндометрия [14, 17]. Дефекты рецептивности эндометрия могут быть причиной неоднократных не­удач в программах ВРТ при нормальном качестве эмбрионов. В связи с этим интерес ученых всего мира вызывает установление потенциальных причин снижения качества состояния эндометрия - биомаркеров рецептивности эндометрия, а также возможности коррекции его патологического состояния.

Эндометрий рецептивен во II фазу менструального цикла, при этом может находиться в различных функциональных состояниях, которые включают нейтральную, рецептивную и нерецептивную, или рефрактерную фазы [1, 4, 7]. Именно способность эндометрия адекватно реагировать на циклические колебания уровня стероидных гормонов крови приводит к формированию необходимых ультраструктурных изменений в эндометрии для возникновения «окна имплантации» и в конечном результате обеспечивает имплантацию оплодотворенной яйцеклетки, наступление и развитие беременности. Специфическим морфологическим маркером полноценной рецептивности эндометрия служит появление пиноподий в покровном эпителии [4-6, 18].

A. Psychoyos и соавт. [19, 21] высказали предположение, а позднее подобные исследования были проведены и другими авторами, что появление пиноподий совпадало с непродолжительным «окном имплантации». Пиноподии активно изучаются как маркер рецептивности эндометрия [21]. В 2004 г. K. Pantos и соавт. [22] была предпринята попытка внедрить в клиническую практику определения пиноподий для улучшения исходов программ ВРТ.

Однако следует отметить, что в мировой литературе имеется достаточно много публикаций, подвергающих сомнению ценность пиноподий как маркера «окна имплантации» [14, 15].

Другим направлением, оценивающим функциональную полноценность эндометрия, являются исследования прогестероновых и эстрогеновых рецепторов (ПР и ЭР соответственно) в слизистой тела матки. На протяжении всего менструального цикла уровень гормонов изменяется, что приводит к развитию овуляции, при которой абсолютное содержание стероидных гормонов в плазме крови не является столь важным, сколько количество и соотношение полноценных рецепторов в эндометрии [3, 4, 8, 20]. Таким образом, определение ПР и ЭР методом иммуногистохимического окрашивания биоптатов в среднесекреторную фазу позволяет уточнить и дополнить патоморфологическое исследование и может стать одним из ценных диагностических маркеров восприимчивости эндометрия к эмбриону [3-5].

Стероидные гормоны оказывают влияние не только на появление и созревание пиноподий, но и на экспрессию большинства идентифицированных молекул, вовлеченных в процесс имплантации эмбриона. Наиболее широко в литературе обсуждается фактор, ингибирующий лейкемию (ЛИФ), и его влияние на рецептивность эндометрия и процесс имплантации [2, 9].

Определение ЛИФ в эндометрии является важным прогностическим фактором у пациенток с бесплодием, особенно имеющих в анамнезе повторяющиеся неудачные попытки ЭКО. Для данного контингента больных характерно нарушение экспрессии ЛИФ, что также подтверждает важную роль этого фактора в процессе имплантации [9].

Популярной гипотезой, объясняющей снижение частоты наступления беременности в программах ЭКО с антагонистами ГнРГ, является преждевременная лютеинизация фолликулов, клинически выражающаяся в повышении концентрации прогестерона в сыворотке крови более 1,5-1,6 нг/мл в день введения триггера овуляции. Наблюдения E. Papa­nikolau и соавт. [20] свидетельствуют, что даже небольшое превышение этого пограничного уровня концентрации прогестерона оказывает крайне неблагоприятное влияние на потенциал имплантации эмбрионов хорошего качества при их переносе в полость матки, что неминуемо сказывается на частоте наступления беременности. В то же время другие авторы [13, 23] не находят взаимосвязи преждевременной лютеинизации фолликулов и вероятности наступления беременности.

Цель настоящего исследования - клинико-морфологическая и иммуногистохимическая оценка рецептивности эндометрия у женщин с проведенной контролируемой овариальной стимуляцией, при выявленной преждевременной лютеинизации и нормальных преовуляторных значениях прогестерона.

Исследованы Pipelle биоптаты эндометрия у 42 женщин репродуктивного возраста.

Из 42 пациенток, включенных в исследование, у 36 материал был получен на 5-й день после трансвагинальной пункции в стимулированном цикле. Перенос эмбрионов в данной группе пациенток был отменен. Из 36 женщин группы исследования (основная) у 17 выявлен феномен преждевременной лютеинизации - уровень прогестерона на момент введения триггера овуляции составил более 4,7 нмоль/л, у 19 пациенток уровень прогестерона на день введения триггера овуляции был менее 4,7 нмоль/л. Группу контроля составили 6 женщин репродуктивного возраста, имеющих регулярный менструальный цикл и подтвержденную фертильность (хотя бы одну самостоятельную беременность и роды в анамнезе). Забор эндометрия у женщин группы контроля произведен на 19-25-й день естественного менструального цикла.

Критериями исключения пациенток из исследования явились: применение оральных или внутриматочных средств контрацепции в течение последних 6 мес и наличие признаков органической патологии эндометрия (хронического эндометрита и гиперпластических процессов).

Пациенткам, включенным в исследование, проводились морфологическое и иммуногистохимическое исследования биоптатов функционального слоя эндометрия с определением количества клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий, изучением характера экспрессии рецепторов к стероидным гормонам и ЛИФ. Также произведен забор крови в день введения триггера овуляции с целью определения уровня прогестерона.

Биопсию эндометрия проводили в асептических условиях без предварительной анестезии из области дна матки с помощью аспирационной кюретки на 5-й день после трансвагинальной пункции и 6-8-й день после овуляции. Овуляция отслеживалась совместно двумя методами: ультразвуковым мониторингом цикла, а также определением пика ЛГ в моче. Полученные биоптаты фиксировали в 10% нейтральном формалине, заливали в парафин, готовили срезы толщиной 5 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином. Проводилось гистологическое датирование эндометрия, оценка процента клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий с помощью светового микроскопа при увеличении 400 в 5 полях зрения. Иммуногистохимические реакции проводили на депарафинированных срезах толщиной 4-5 мкм по общепринятым протоколам.

В качестве первых антител использовали моноклональные антитела к ЭРα («DAKO», Дания; Ready-to-use), ПР («DAKO», Дания; Ready-to-use) и ЛИФ («R@D Systems», США) 1:100.

Результаты для ЭР и ПР анализировали с учетом количества окрашенных клеток и интенсивности окраски в поверхностном эпителии, железах и строме эндометрия, используя метод гистологического счета HISTO Score по формуле: HS=1а+2b+3c, где а - % слабоокрашенных клеток; b - % умеренно окрашенных клеток; с - % сильно окрашенных клеток; 1, 2, 3 - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах. Степень выраженности экспрессии ЭР и ПР оценивали следующим образом: 0-10% - отсутствие экспрессии; 11-100% - слабая экспрессия; 101-200% - умеренная экспрессия; 201-300% - выраженная экспрессия. Результаты иммуногистохимической реакции для ЛИФ оценивали полуколичественным методом в баллах по общепринятой методике: отсутствие иммуноокрашенных клеток (–) - 0 баллов; менее 5% иммуноокрашенных клеток (±) - 0,5 балла, менее 20% иммуноокрашенных клеток (+) - 2 балла; от 20 до 40% окрашенных клеток (++) - 4 балла; более 40% окрашенных клеток (+++) - 6 баллов.

Для автоматизации статистической обработки использовали статистический пакет Statistica 10 («StatSoft Inc.», США).

Возраст обследованных пациенток (n=42) колебался от 24 до 40 лет и в среднем составил 32,1±7,8 года. Первичное бесплодие отмечено у 22 (40%) пациенток, вторичное - у 24 (43,6%). Продолжительность бесплодия колебалась от 3 до 14 лет (в среднем 6,5±3,2 года).

Из 36 пациенток стимулированной группы исследования у 17 был зарегистрирован повышенный уровень преовуляторного прогестерона (>4,7 нмоль/л), у 19 пациенток показатели прогестерона соответствовали норме.

В группе исследования из 36 пациенток у 4 был выявлен очаговый склероз стромы.

Параметры фолликуло-, оо- и эмбриогенеза были адекватными. Динамика роста и структурной трансформации эндометрия в ходе программ соответствовала адекватной ультразвуковой картине.

В стимулированной группе пациенток при морфологическом исследовании биоптатов наблюдали эндометрий ранней стадии секреции в 52,2% случаев и средней стадии фазы секреции в 43,5%. При гистологическом исследовании образцов, при изучении поверхностного эпителия и оценке количества клеток с наличием пиноподий были обнаружены клетки поверхностного эпителия, в среднем 18,4% (от 0 до 40%). При анализе биоптатов у пациенток с выявленным феноменом преждевременной лютеинизации (17 женщин) ранняя стадия секреции была отмечена в 23,5% случаев, средняя стадия фазы секреции - в 70,5%. При изучении поверхностного эпителия при гистологическом исследовании было выявлено: количество пиноподий на поверхности клеток соответствовало 14,5%.

При иммуногистохимическом исследовании в группе пациенток с нормальным уровнем прогестерона (19 женщин) выявлено высокое и умеренное содержание ПР в железах и строме. Уровень экспрессии ПР колебался от 10 до 220% по системе оценки HISTO Score, что в среднем составило 127±75 и 174±32% соответственно. При оценке иммуно­окрашивания ЭР эндометрия у пациенток основной группы исследования была отмечена умеренная и низкая экспрессия ЭР. В железах и строме уровень ЭР колебался от 10 до 180% и составил в среднем 83,5±47 и 49±28% соответственно.

При высоких значениях преовуляторного прогестерона уровень экспрессии ПР в железах соответствовал 105±65%, в строме - 169±28%. Уровень экспрессии ЭР в железах составил 53,4±36%, в строме - 34,3±21%.

Отношение ПР/ЭР в эндометрии, в строме, по данным литературы [4], в норме составляет от 2 до 4. У пациенток основной группы отношение ПР/ЭР колебалось от 2,8 до 17 и в среднем составило 6,3 и 8,9 у женщин с высоким уровнем прогестерона на день введения триггера овуляции, что отражает снижение количества ЭР (рис. 1).

В основной группе пациенток с нормальной концентрацией прогестерона экспрессия ЛИФ варьировала от высокого уровня до полного отсутствия, высокая экспрессия отмечена в 54,5% случаев как в апикальной части поверхностного эпителия эндометрия, так и в железах, умеренная экспрессия - в 22,7% случаев, низкая - в 22,7%. При выявленной преждевременной лютеинизации высокая экспрессия ЛИФ зафиксирована в 52,9% случаев, умеренная - в 23,5% и низкая - в 17,6% (рис. 2).

В контрольной группе (n=6) при морфологическом исследовании биоптатов наблюдали эндометрий ранней и средней стадии фазы секреции. При анализе поверхностного эпителия и оценке количества клеток с наличием зрелых пиноподий обнаружено, что в среднем 50% (от 40 до 60%) клеток поверхностного эпителия содержат зрелые пиноподии. При иммуногистохимическом исследовании выявлено высокое и умеренное содержание ПР и ЭР как в железистых структурах, так и в ядрах клеток стромы (рис. 3).

В основной группе пациенток с высоким уровнем прогестерона количество пиноподий в эндометрии было на 4% меньше, чем у пациенток с нормальным его уровнем. Количество ЭР как в строме, так и железах было существенно ниже у пациенток с высоким уровнем прогестерона в сравнении с пациентками с уровнем прогестерона менее 4,7 нмоль/л (р<0,05). Средняя стадия секреции выявлена у 70,5% пациенток с высоким уровнем преовуляторного прогестерона, а среднее значение отношения ПР/ЭР в строме было выше в группе с высоким уровнем прогестерона (р<0,05). Указанные различия могут свидетельствовать о нарушении рецептивных свойств эндометрия, что в свою очередь может быть причиной неудачных попыток ЭКО. Однако следует отметить, что в показателях ЛИФ у пациенток с высоким и нормальным уровнем прогестерона статистических различий не выявлено. У пациенток контрольной группы имели место высокие показатели ПР/ЭР как в строме, так и в железах, экспрессия ЛИФ соответствовала 5-6 баллам в апикальной части покровного эпителия, также как и в железах, количество пиноподий составило в среднем 28%, что имеет статистические различия с исследуемой группой пациенток (р<0,05).

Более низкая частота наступления беременности в циклах, где отмечается феномен преждевременной лютеинизации фолликулов объясняется влиянием высоких цифр прогестерона на состояние рецептивности эндометрия [17, 18]. На сегодняшний день не разработана четкая тактика предотвращения негативного влияния феномена преждевременной лютеинизации на эффективность программ ЭКО. C этой целью обсуждаются вопросы о раннем назначении хорионического гонадотропина человека (чХГ) [12], о применении препарата антипрогестеронового ряда мифепристона [11], о криоконсервации всех полученных эмбрионов и переносе их в полость матки в следующем менструальном цикле [7], о назначении малых доз чХГ в позднюю фолликулярную фазу [7].

Поиску эффективных методов оценки имплантационного потенциала эндометрия посвящено большое количество исследований. В настоящей работе проведена оценка рецептивности эндометрия у 36 женщин, из которых у 17 была диагностирована преждевременная овуляция фолликулов, повышение уровня прогестерона более 4,7 нмоль/л в день введения триггера овуляции, у 19 пациенток были нормальные цифры преовуляторного прогестерона. При этом параметры фолликуло-, оо- и эмбриогенеза были адекватными. Динамика роста и структурной трансформации эндометрия в ходе программ соответствовала адекватной ультразвуковой картине. Все это явилось предпосылкой для более углубленного исследования имплантационных свойств эндометрия у данной группы больных.

И действительно, количество клеток поверхностного эпителия с наличием зрелых пиноподий в период предполагаемого «имплантационного окна» различалось в группах исследования и контроля (в среднем 18,4% в группе с нормальным уровнем прогестерона, 14,5% - в группе с повышенным его уровнем и 50% - в контрольной группе). Снижение количества эндометриальных пиноподий было отмечено G. Nikas [19] у пациенток с нарушением имплантации в анамнезе и у женщин с бесплодием неясного генеза.

Также у пациенток, составивших группу исследования, отмечен дисбаланс в экспрессии рецепторов к стероидным гормонам, в основном за счет снижения количества ЭР. Аналогичные результаты были представлены в работе Е.В. Дюжевой [4]. Взаимосвязи экспрессии рецепторов к стероидным гормонам и выраженности эндометриальных пиноподий или экспрессии ЛИФ не отмечено.

По результатам проведенного нами исследования, экспрессия цитокина ЛИФ в преимплантационном эндометрии у женщин с повышенным уровнем прогестерона достоверно снижена по сравнению с контрольной группой, однако разницы в группах с нормальным и повышенным уровнем прогестерона получено не было, что может свидетельствовать о влиянии стимуляции суперовуляции на качество рецептурного аппарата эндометрия. Также отмечена взаимосвязь между экспрессией ЛИФ и эндометриальными пиноподиями, в период расцвета которых и определяется максимальная концентрация цитокина, что согласуется с данными литературы [1, 2].

Повышение уровня преовуляторного прогестерона в индуцированном цикле негативно сказывается на имплантационных свойствах эндометрия, что выражается в снижении качества рецепторного аппарата за счет повышения отношения ПР/ЭР, снижения количества ЭР, уменьшения количества пиноподий.

Повышение уровня преовуляторного прогестерона не влияет на показатели экспрессии ЛИФ, достоверных различий получено не было.

Необходимы дальнейшие исследования, направленные на поиск методов, препятствующих развитию феномена «преждевременной лютеинизации» в преовуляторном периоде индуцированного цикла.