Корреляционно-регрессионный анализ влияния регуляторных молекул на фолликулогенез в норме и при патологии

Ранее проведенные коллективом авторов [4] исследования были посвящены выявлению патологии микроокружения ооцитов на разных стадиях роста фолликулов при эндокринном бесплодии. При этом авторы не оценивали связь выявленных изменений с исходами лечебных циклов ВРТ.

Вместе с тем хорошо известно, что дизрегуляция процессов роста и созревания фолликула, отражением чего является изменение состава фолликулярной жидкости, - одна из ведущих причин неудовлетворительных исходов лечебных циклов ЭКО [1, 8]. В свою очередь доказано, что рост и селекция доминантного фолликула скоординированы с интенсивностью секреции в фолликулярную жидкость гормонов и факторов роста и их биологическими эффектами [2].

Закономерен вопрос о вкладе каждого из них в достижение положительного результата лечения при эндокринном бесплодии.

В связи с вышесказанным логическим продолжением работы [4] стал математический анализ парных взаимосвязей переменных. В качестве независимой переменной служили сигнальные молекулы, являющиеся ключевыми на определенных этапах фолликулогенеза, динамика которых определялась в фолликулах разной степени зрелости (III-VIII класс). В качестве зависимой переменной были приняты интегральные показатели оценки исходов лечебных циклов ВРТ.

Цель настоящей работы - выявление силы и характера взаимосвязей влияния гормонов и факторов роста на показатели эффективности программы ЭКО и ПЭ при эндокринном бесплодии.

Проанализированы образцы фолликулярной жидкости (ФЖ) 169 полостных фолликулов на разных стадиях развития, полученных от пациенток, проходивших лечение в циклах ЭКО.

В ранее проведенном исследовании [4], данные которого использованы для математической обработки, образцы ФЖ получали от пациенток репродуктивного возраста с нарушениями менструальной и репродуктивной функции на фоне хронической ановуляции и гиперандрогении (ГА, n=65) или функциональной гиперпролактинемии (ГП, n=59). Контрольную группу составили образцы ФЖ от женщин с регулярным двухфазным менструальным циклом и трубно-перитонеальным фактором бесплодия (ТПФ, n=45).

Возраст женщин варьировал от 21 года до 42 лет (в среднем 32,7±1,5 года). Период предшествующего бесплодия у обследованных супружеских пар составил 3-18 лет (в среднем 7,6±1,5 года).

Для установления причины бесплодия пациенткам проводили стандартное клинико-лабораторное обследование. Стимуляцию овуляции во всех лечебных циклах осуществляли с использованием препаратов а-ГнРГ (декапептил-дейли) в сочетании с пурегоном. В качестве индуктора овуляции использовали овитрель.

Образцы ФЖ для исследования получали во время трансвагинальной пункции фолликулов разной степени зрелости (объем ФЖ варьировал от 0,1 до 8 мл для диаметра фолликула от 0,2-0,9 до 16-20 мм соответственно). Далее образцы помещали в стерильные пластиковые пробирки и использовали для анализа. Образцы анализировали по принципу: «одна пациентка - один доминантный фолликул» или «одна пациентка - 2-3 фолликула разной степени зрелости». Стадии развития фолликулов определяли в зависимости от размера диаметра. Таким образом, в исследование включены фолликулы от ранних антральных до преовуляторных (III-VIII классы) [12].

Концентрацию факторов роста и стероидных гормонов определяли при помощи иммуноферментного и иммунолюминесцентного анализов. Для определения концентрации эпидермального фактора роста (ЭФР) использовали набор Invitrogen Immunoassay KitKHG0062; концентрации трансформирующего фактора роста-β (ТФР-β) - BMS249/3 humanTGF-β1 Platinum ELISA; концентрации фактора роста фибробластов (основная форма) (оФРФ) - Invitrogen ELISA KitHG0021; концентрации эстрадиола (Е2) - Immulite 1000 Estradiol (PILKE2-14); концентрации тестостерона - Immulite 1000 Total Testosterone (PILKTW-12); концентрации эндотелина-1 - Bl-20052 Endotelin (1-21); концентрации инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1) - Non-Extraction IGF-IELISA DSL-10-2800.

Внутригрупповые показатели сравнивали со стадией раннего антрального фолликула. Показатели испытуемых групп сравнивали с данными соответствующей стадии развития фолликула в контрольной группе (ТПФ).

Эффективность программ ВРТ оценивали с использованием следующих показателей: частота нормального оплодотворения (ЧНО), частота наступления имплантации (ЧНИ), число полученных эмбрионов (ЧПЭ), кумулятивный балл полученных эмбрионов (КБПЭ) в соответствии с классификацией Гарднера [7].

Для проверки каждой из трех выборок (ГА, ГП, ТПФ) на однородность было применено правило «трех сигм», в результате чего были исключены неоднородные данные. Чтобы идентифицировать регуляторные молекулы, оказывающие наибольшее влияние на показатели эффективности ЭКО, были построены регрессионные линейные модели зависимости для каждого из 4 показателей от каждого из 9 факторов во всех трех группах с помощью метода наименьших квадратов. Полученные модели (n=108) были проверены на адекватность с помощью критерия Фишера и коэффициента корреляции между фактическими и смоделированными показателями ЭКО. Адекватными считались модели, у которых критерий Фишера и коэффициент корреляции имели значения больше табличного.

Качество аппроксимации истинной зависимости линейным уравнением регрессии оценивалось с помощью дисперсионного отношения (критерия Фишера F). Если при сравнении F с табличным значением Fтабл. отмечалось, что F>Fтабл., то гипотеза об адекватности математической модели принималась с доверительной вероятностью 0,95.

Проверка статистической значимости оценки коэффициента корреляции (R) осуществлялась сравнением его модуля с табличным значением Rтабл. (при доверительной вероятности 0,95). Если модуль оценки коэффициента корреляции был больше табличного, то оценка R считалась статистически значимой, а независимая переменная X была отнесена к существенно влияющим на зависимую переменную Y.

Полученные данные выражали графически (линии регрессии) и математически (уравнения регрессии).

Состав ФЖ определяет качество ооцита и в какой-то мере исход программ ВРТ [5]. Полученные нами математические модели позволяют выявить и проанализировать закономерности взаимосвязи показателей, а также прийти к пониманию, какие биологические механизмы опосредуют возникновение математических зависимостей.

Пары «гормон/фактор роста - показатель эффективности ЭКО», модели взаимодействия которых оказались адекватными, приведены в таблице.

Установлено, что в контрольной группе факторами, определяющими частоту нормального оплодотворения и, следовательно, число полученных эмбрионов, являются уровень Е2 и концентрация ЭФР (рис. 1, 2).

Биологические эффекты действия названных факторов на фолликуло- и оогенез хорошо известны. Считается, что именно стимулирующее эндокринное воздействие Е2 на гормонально-зависимых стадиях развития фолликулов обеспечивает сначала рост и созревание, а потом и овуляцию доминантного фолликула, обеспечивая тем самым успешное оплодотворение полученных ооцитов. Примечательно, что при повышении уровня Е2 количество точек выборки рядом с прямой регрессии начинало уменьшаться, а линия регрессии - полого снижаться, что, вероятно, может свидетельствовать об узости эффективного диапазона действия стероида (см. рис. 1).

Пара- и аутокринные влияния ЭФР, секретируемого гранулезными клетками созревающего фолликула, проявляются в протекторных эффектах в отношении мелких антральных фолликулов человека, обеспечивая их выживание в условиях растущего уровня Е2 [6]. В преовуляторных фолликулах человека ЭФР способствует созреванию ядра и цитоплазмы ооцитов. Показано стимулирующее действие ЭФР на секрецию прогестерона [10]. Очевидно, совокупность данных влияний может обеспечивать соответствующий эффект в отношении ЧПЭ (см. рис. 2).

При анализе ключевых факторов, влияющих на эффективность ВРТ при ГП, выявлены отличия от аналогичных показателей контрольной группы. Дополнительно нами обнаружена зависимость ЧНО от показателей тестостерона и ИФР-1 (рис. 3, 4), а ЧНИ - от уровня эндотелина-1 и ТФР-β.

В настоящее время хорошо изучено влияние ИФР-1 на стимуляцию пролиферации гранулезных клеток и их дальнейшую дифференцировку, сенсибилизацию к действию ФСГ и Е2. Показаны анти­апоптотические эффекты ИФР-1 в гранулезных клетках [14]. В антральной жидкости доминантного фолликула определяется высокий уровень ИФР-1 и низкий - андрогенов, и, напротив, для атретических фолликулов характерна высокая концентрация андрогенов и низкая - ИФР-1 [9, 14]. Найденные различия в составе ФЖ доминантных и атретических фолликулов легли в основу теории об «эстрогенном» или «андрогенном» микроокружении, влияющем на созревание ооцита [6, 15].

Ранее нами было показано, что ооциты в доминантных фолликулах при ГП развиваются в условиях «андрогенного» микроокружения и активации апоптоза [9], что, вероятно, и объясняет обнаруженные эффекты регуляторных молекул на ЧНО в представленной работе.

Таким факторам роста, как ТФР-β и эндотелин-1, уделялось большое внимание в нашем исследовании. Они принимают участие в трансформации эндометрия в процессе подготовки его к имплантации бластоцисты, что сопровождается изменением проницаемости сосудистого русла [3, 10].

Фактором роста, влияние которого на наступление имплантации было расценено как сильное, стал ТФР-β, определяющий распознавание имплантирующейся бластоцисты материнским организмом. Для семейства ТФР также характерна регулирующая функция ФСГ-индуцированного биосинтеза стероидов клетками гранулезы [13].

Также было обнаружено сильное влияние эндотелина-1 на ЧНИ при ГП (y = -0,55x+10,19), что отличалось от показателей контрольной группы и, вероятно, может являться доказательством изменения при ГП процессов неоангиогенеза как одного из ключевых событий, влияющих на наступление имплантации. В литературе [11] имеются данные, оценивающие способность эндотелина-1 отвечать за регуляцию роста, созревания и деградацию эндотелиоцитов.

При исследовании взаимодействий, характерных для ГА, стало выявление статистически значимой линейной зависимости критерия КБПЭ, характеризующего качество полученных эмбрионов, от концентрации оФРФ и ТФР-β (рис. 5, 6).

Помимо сказанного выше относительно оФРФ, следует обратить внимание также на то, что, являясь ангиогенным белком, в общем смысле он известен также как митоген, способный накапливаться в экстрацеллюлярном матриксе и инициировать процессы ремоделирования, запуская, таким образом, неоангиогенез [10]. Вероятно, указанные процессы играют чрезвычайно важную роль и в ходе раннего эмбриогенеза человека.

Полученные данные о тесноте линейной (корреляционной) связи между парой признаков КБПЭ - ТФР-β, подтверждают опубликованные ранее результаты о повышении секреции ТФР-β в раннем эмбриогенезе у млекопитающих [13]. Данный фактор роста, выступая регулятором клеточной пролиферации и дифференцировки, способствует формированию бластоцисты [6, 7], а впоследствии влияет на процессы адгезии бластоцисты и инвазии трофобласта [11, 13].

Ранее был продемонстрирован факт нарушения формирования бластоцист, характерного для группы ГА, который коррелировал с низким содержанием ТФР-β в ФЖ доминантных фолликулов, полученных при лечении пациенток с ГА в циклах ВРТ [9].

Таким образом, идентифицированы регуляторные молекулы, являющиеся ключевыми на этапах нормального и патологического фолликулогенеза (эстрогены и ЭФР при нормальном фолликулогенезе; ИФР-1, тестостерон, ТФР-β, эндотелин-1 и ЭФР при ГП; оФРФ, ТФР-β, эндотелин-1 - при ГА), изменение экспрессии которых напрямую влияет на качество формирующегося ооцита, и косвенно - на эффективность оплодотворения и имплантации эмбриона.