Особенности апоптоза лимфоцитов у женщин с регрессирующей беременностью в анамнезе

Запрограммированная клеточная гибель, или апоптоз, является универсальным физиологическим процессом, защитный механизм которого направлен на запуск самоуничтожения патологически измененных, инфицированных, мутировавших, выполнивших свою биологическую функцию клеток [1, 2].

Программированная клеточная смерть контролируется и регулируется большим числом факторов. К индукторам апоптоза относятся сигнальные молекулы и рецепторы этих молекул: Fas/FasR, TNF/TNFR1, цитокины (TNF-α, TGF-β, IFN-γ), онкосупрессоры (р53, р21, pRB), к ингибиторам клеточной гибели — Bcl-2, Bcl-xl и др. Запрограммированная гибель ограничивает экспансию активированных клонов клеток, препятствуя развитию аутоиммунных и воспалительных реакций, поэтому нарушение регуляции апоптоза иммунокомпетентных клеток приводит к изменениям в иммунной системе и возникновению различных заболеваний, связанных с усилением или, наоборот, подавлением процессов апоптоза [3—8]. В этой связи большой интерес представляет оценка роли программированной клеточной гибели как одного из механизмов иммунорегуляции при патологических состояниях женской репродуктивной функции, в частности, при хроническом эндометрите, с которым, в соответствии с резолюцией FIGO World Congress (2006), ассоциирован каждый случай регрессирующей беременности [9, 10]. Хронический воспалительный процесс в ткани эндометрия характеризуется активацией клеточных и гуморальных реакций, что выражается в увеличении количества Т-лимфоцитов, NK-клеток, макрофагов, усилении продукции в эндометрии провоспалительных цитокинов, различных ростовых факторов и протеолитических ферментов, сопровождающихся нарушением соотношения пролиферации и апоптоза клеток [11—14].

Цель исследования — оценить особенности регуляции и реализации апоптоза лимфоцитов крови и ткани эндометрия у женщин с регрессирующей беременностью в анамнезе.

Проведено иммунологическое обследование 21 женщины репродуктивного возраста (средний возраст 29,4±4,6 года) с неразвивающейся беременностью в анамнезе, которые составили основную группу. Пациентки поступали на реабилитацию в ФГБУ «НИИ ОММ» МЗ РФ через 3,1±0,7 мес после выскабливания полости матки по поводу регрессирующей беременности и находились в условиях стационара в среднем 5,3±1,4 дня. Женщины основной группы помимо традиционной терапии получали курс лечения методом кавитационного орошения полости матки физиологическим раствором с помощью ультразвукового аппарата АК100 фирмы «Фотек» (5 процедур длительностью 3—5 мин). Орошение полости матки проводили на 7—9-й день менструального цикла. Обследование осуществляли до физиотерапевтического воздействия и через 1 мес после лечения.

Контрольную группу (сравнения) составили 9 женщин репродуктивного возраста (32,0±3,6 года) без соматической и гинекологической патологии.

Оценку уровня экспрессии лимфоцитами крови Fas-рецептора (CD95) проводили методом проточной цитометрии на анализаторе FACSCalibur («Becton Dickinson», США) с использованием моноклональных антител того же производителя. Содержание TNF-α, p53, Bcl-2 в сыворотке крови определяли методом твердофазного иммуноферментного анализа, согласно рекомендациям производителей реагентов с помощью тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» (Россия) и «Bender MedSystems» (Австрия). Детекцию результатов исследования осуществляли на иммуноферментном анализаторе Multiskan МСС/340 фирмы «Labsystems» (Финляндия).

Оценку маркеров реализации апоптоза проводили в биоптате эндометрия. Забор материала осуществляли методом пайпель-биопсии на 7—9-й день менструального цикла до и после терапевтического воздействия. Путем механического измельчения биоптат эндометрия доводили до гомогенизированного состояния, из полученного гомогената на градиенте плотности выделяли фракцию мононуклеаров [15].

Интенсивность реакций апоптоза в мононуклеарах крови и ткани эндометрия оценивали по одновременному связыванию клетками двух маркеров — аннексина V (AnV) и пропидиум йодида (PI) с помощью набора реактивов ANNEXIN V-FITC APOPTOSIS DETECTION KIT I («BD Pharmingem», США) методом проточной цитометрии в программе CELLQuest. В каждом образце анализировали 10 000 событий. Результаты выражали в процентах от общего числа клеток. Аннексин V применяли для выявления лимфоцитов, вступивших в апоптоз (AnV⁺-клетки). Пропидиум йодид использовали в качестве маркера жизнеспособности клеток (AnV^–PI^–-клетки) и клеточного некроза (AnV^–PI⁺-клетки). Статистическую обработку полученных данных проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica for Windows 6.0 с предварительной оценкой нормальности распределения. При нормальном распределении признака данные приводились в виде средней величины (M) и ошибки среднего (m). Для оценки достоверности различий между группами использовали процедуру однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Различия считали достоверными при уровне значимости не более 0,05, на уровне тенденций — при 0,05

В результате проведенного исследования в биоптате эндометрия женщин с регрессирующей беременностью количество эндометриальных лимфоцитов, подвергшихся апоптозу (AnV⁺-клетки), статистически значимо превышало значение аналогичного параметра у пациенток после физиотерапевтического воздействия и у здоровых женщин в 3,1 и 5,1 раза соответственно (табл. 1).

Независимо от характера сигнала, инициирующего к апоптозу, приобретение клеткой способности фиксировать на мембране белок аннексин свидетельствует о вступлении клетки в состояние апоптоза. Клетки, находящиеся на ранних, обратимых этапах апоптоза, не способны накапливать внутриклеточно пропидиум йодид (PI) и имеют фенотип AnV⁺PI^–. Когда характер апоптоза клеток становится необратимым, PI свободно поступает в цитоплазму и гибнущая клетка приобретает фенотип AnV⁺PI⁺.

По данным «аннексинового» теста, наличие в анамнезе женщин неразвивающейся беременности ассоциировано с увеличением количества эндометриальных лимфоцитов как на ранних (AnV⁺/PI^–), так и на поздних стадиях апоптоза (AnV⁺/PI⁺) в 6,4 и 4,4 раза соответственно по сравнению со здоровыми женщинами, что свидетельствует о запуске механизмов, направленных на ограничение пролиферации реактивных клеток при хроническом воспалительном процессе.

После лечения содержание апоптотических AnV⁺/PI^– и AnV⁺/PI⁺ лимфоцитов снижалось в 1,8 и 5,4 раза соответственно, приближаясь к значениям этих параметров у здоровых женщин. Необходимо отметить, что количество клеток на ранней (AnV⁺/PI^–) и поздней (AnV⁺/PI⁺) стадиях апоптоза у пациенток основной группы до лечения было практически одинаковым. После физиотерапевтического воздействия количество лимфоцитов на начальных этапах фрагментации ДНК и конденсации хроматина (ранний апоптоз), когда реализация апоптоза может быть приостановлена действием ингибиторов, в 2,5 раза превышало содержание лимфоцитов на необратимом этапе клеточной гибели, характеризующемся нарушением целостности клеточной мембраны и формированием апоптотических телец.

Одновременно с оценкой клеточной гибели в биоптате ткани эндометрия проведено исследование апоптоза на системном уровне. Установлено, что реализация программы «негативной активации» у женщин основной группы ограничивается локальным уровнем в ткани эндометрия, поскольку, по данным «аннексинового» теста, не обнаружено достоверных различий в количестве лимфоцитов крови, находящихся в апоптозе, у женщин сравниваемых групп (p>0,1).

При сравнении результатов «аннексинового» теста в крови и биоптате эндометрия выявлено, что у женщин, в анамнезе которых зарегистрирована регрессирующая беременность, уровень эндометриальных лимфоцитов, подвергшихся апоптозу, значительно превышал количество апоптотирующих лимфоцитов крови (22,15% в биоптате эндометрия против 11,38% в крови), свидетельствуя о реализации программы «негативной активации» преимущественно на тканевом уровне. После физиотерапевтических процедур у пациенток наблюдалась обратная тенденция — 7,16% апоптотических лимфоцитов в биоптате эндометрия против 12,68% в крови, что сопоставимо со значениями аналогичных показателей у здоровых женщин — 4,33% в эндометрии против 10,53% в крови.

В связи с тем, что патологическая гибель лимфоцитов путем некроза происходит при остром воспалительном процессе, количество клеток с фенотипом AnV^–/PI⁺ (некротизированные) было достоверно снижено относительно содержания лимфоцитов, подвергшихся апоптотической гибели (AnV⁺/PI^–+AnV⁺/PI⁺), как в крови, так и в биоптате эндометрия женщин обследованных групп. Содержание лимфоцитов крови, погибших в результате некроза, было увеличено в 3,9 раза у пациенток основной группы до лечения (p=0,07), в биоптате эндометрия не выявлено достоверных отличий в количестве некротизированных клеток у женщин сравниваемых групп.

По результатам исследования маркеров регуляции апоптоза лимфоцитов крови у женщин основной группы до и после физиотерапевтического воздействия наблюдалось сниженное содержание клеток, экспрессирующих на своей поверхности Fas-рецептор, в общей популяции лимфоцитов, а также в популяции Т-клеток, Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов, что указывает на циркуляцию в крови активированных клонов клеток (табл. 2).

Полученные результаты исследования согласуются с данными литературы, свидетельствующими о том, что сниженная способность к экспрессии Fas-антигена запускает механизмы, позволяющие клеткам «ускользать» от программируемой гибели [1, 2].

Уменьшение содержания лимфоцитов, несущих маркер апоптогенного сигнала CD95, у пациенток основной группы зарегистрировано на фоне увеличения в сыворотке крови концентрации индуцирующего клеточную гибель цитокина TNF-α (в 4,2 и 2,7 раза до и после лечения соответственно). Помимо проапоптогенного действия, TNF-α обеспечивает широкий спектр биологических сигналов, участвующих в регуляции иммунного гомеостаза. Повышенный уровень провоспалительного медиатора TNF-α у пациенток с регрессирующей беременностью в анамнезе свидетельствует о латентном воспалительном процессе, основном патогенетическом звене хронического эндометрита. У пациенток основной группы после курса лечения статистически значимо снизилась (в 1,6 раза) концентрация TNF-α относительно уровня, зарегистрированного до лечения, не достигая уровня у здоровых женщин.

При оценке содержания растворимых регуляторов апоптотической гибели клеток выявлено, что сывороточный уровень белка p53, который угнетает пролиферацию генетически дефектных клеток и индуцирует апоптоз, и концентрация выполняющего обратную функцию негативного регулятора апоптоза Bсl-2 снижались после проведения физиотерапевтического воздействия.

Таким образом, при исследовании маркеров регуляции и реализации программируемой клеточной гибели установлено, что в биоптате эндометрия женщин с регрессирующей беременностью в анамнезе повышено содержание клеток на ранних (AnV⁺/PI^–) и поздних (AnV⁺/PI⁺) стадиях апоптоза, снижена экспрессия маркера готовности лимфоцитов крови к апоптозу CD95 на фоне увеличения содержания в сыворотке крови проапоптотического фактора TNF-α. Эффект физиотерапевтического воздействия через месяц после проведения курса лечения связан с уменьшением количества лимфоцитов биоптата эндометрия, вступивших в апоптоз, и уровня TNF-α в сыворотке крови. Перспективным направлением исследований является использование определения маркеров апоптоза в качестве критериев оценки влияния терапевтического воздействия на показатели иммунной системы женщин с регрессирующей беременностью в анамнезе.