На сегодняшний день криоконсервация «невостребованных» эмбрионов является важной составляющей программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ). Для криоконсервации эмбрионов используют два основных метода: метод медленного замораживания (МЗ) и активно развивающийся в последние несколько лет метод витрификации. В научной литературе широко дискутируются преимущества и эффективность указанных методов. Некоторыми авторами [1] при сравнении эффективности методов МЗ и витрификации были получены сопоставимые результаты. Напротив, в большинстве исследований применение метода витрификации позволило улучшить выживаемость эмбрионов, а также привело к повышению частоты имплантации и наступления беременности [2—4]. В недавно проведенных исследованиях удалось достичь удовлетворительных результатов при использовании метода МЗ [5, 6]. Таким образом, вопрос, какой метод — витрификация или МЗ — является оптимальным для криоконсервации эмбрионов, остается открытым.

Анализ современной литературы показал, что наиболее часто в клинической практике перенос замороженных/оттаянных эмбрионов проводят в цикле с применением подготовительной гормональной терапии (ПГТ) препаратами эстрогенов и прогестерона, натуральном цикле или стимулированном цикле, в котором развитие фолликула поддерживают небольшими дозами гонадотропинов [7—14]. В настоящее время нет единого мнения относительно способа подготовки эндометрия к переносу криоконсервированных эмбрионов. Как известно, успешность имплантации во многом зависит от качества эмбриона и морфофункционального состояния эндометрия. W. Ma и соавт. [15] в 2003 г. показали, что высокие дозы эстрогенов отрицательно сказываются на экспрессии биомаркеров рецептивности. При этом эстрогены играют важную роль в регуляции процесса имплантации. Клинические исследования, сравнивающие эффективность различных режимов подготовки эндометрия к переносу замороженных/оттаянных эмбрионов, немногочисленны и их результаты противоречивы [7—14]. Так, по данным V. Morozov и соавт., E. Chang и соавт., а также ряда других авторов [10—12], перенос криоконсервированных эмбрионов в натуральном цикле приводил к лучшим результатам при сравнении с режимом ПГТ. J. Konс и соавт. [8], a также M. Sathanandan и соавт. [9], напротив, достоверного различия между указанными методами не получили. Результаты применения чХГ в качестве триггера овуляции в натуральном цикле также неоднозначны. В исследовании, проведенном H. Fatemi и соавт. [13] в 2010 г., частота наступления беременности была выше после переноса размороженных эмбрионов в натуральном цикле при сравнении с натуральным циклом с использованием в качестве триггера овуляции препаратов чХГ. A. Weissman и соавт. [14] в 2009 г. подобного различия между указанными режимами не выявили.

Цель настоящего исследования — сравнение выживаемости эмбрионов 5-го дня развития после криоконсервации методом МЗ и методом витрификации, а также оценка частоты наступления беременности после переноса пациенткам размороженных эмбрионов, криоконсервированных различными способами, в модифицированном натуральном цикле (МНЦ) и после назначения ПГТ.

В исследование включены 185 пациенток в возрасте от 25 до 40 лет, страдающих бесплодием различной этиологии, которым проводился перенос криоконсервированных эмбрионов в период с сентября 2011 г. по сентябрь 2012 г. В зависимости от метода криоконсервации эмбрионов и способа подготовки к переносу замороженных/оттаянных эмбрионов пациентки были разделены на четыре группы (5-я — контрольная). Перенос размороженных эмбрионов, криоконсервированных методом витрификации, проводился пациенткам, получавшим ПГТ (1-я группа; n=61), а также пациенткам в МНЦ (2-я группа; n=49). Перенос размороженных эмбрионов, криоконсервированных методом МЗ, проводился пациенткам, получавшим ПГТ (3-я группа; n=45), а также пациенткам в МНЦ (4-я группа; n=30). Контрольную, 5-ю группу (n=45) составили пациентки, страдающие бесплодием, обусловленным мужским фактором, трубно-перитонеальной формой бесплодия или их сочетанием, которым был проведен перенос нативных эмбрионов в период с января по июнь 2011 г. Пациентки контрольной группы независимо от исхода в случае последующего обращения в исследуемые группы не включались.

Программы ВРТ проводили по общепринятым стандартам. Качество эмбрионов оценивали на основании принятых стандартов в клинике по Гарднеру. Оставшиеся после переноса в полость матки бластоцисты и морулы отличного и хорошего качества были криоконсервированы методом медленного замораживания или методом витрификации.

Витрификацию осуществляли с использованием набора для витрификации Kitazato Cryotop Safety Kit Vitrification VT 401. Криоконсервацию методом МЗ проводили с использованием сред для замораживания эмбрионов Blast Freeze фирмы «MediCult» и программируемых фризеров Cryologic или Planer. Успешно размороженные эмбрионы либо переносили в полость матки, либо повторно криоконсервировали. Число переносимых эмбрионов не превышало 2 (в 18,9% случаев проводили перенос одного эмбриона, в 6,8% — был селективный перенос 1 эмбриона).

В качестве ПГТ использовали препарат эстрадиола (Прогинова 2 мг 3 раза в день; Эстрофем 2 мг 3 раза в день; Дивигель 1 г 3 раза в день). При достижении толщины эндометрия 8 мм и более по данным УЗИ к указанной терапии добавляли препарат прогестерона (Утрожестан 200 мг 3 раза в день интравагинально или гель Крайнон 1 аппликатор 1 раз в день интравагинально). На 5-й день после назначения препарата прогестерона проводили перенос размороженных эмбрионов. Методика переноса эмбрионов в МНЦ состояла в следующем. Пациенткам проводилась фолликулометрия. При достижении, по данным УЗИ, размера фолликула 19—20 мм назначали «овуляторную» дозу хорионического гонадотропина (Прегнил, Овитрель). Со следующего дня после наступления овуляции назначали терапию препаратом эстрадиола (Прогинова 2 мг 2 раза в день внутрь или Дивигель 1 г 2 раза в день наружно) совместно с препаратом прогестерона (Утрожестан 200 мг 3 раза в день интравагинально или гель Крайнон 1 аппликатор 1 раз в день интравагинально). Перенос размороженных эмбрионов проводили на 5-й день от начала указанной терапии. Факт наступления беременности определяли по данным УЗИ при наличии в полости матки плодного яйца. Оценку частоты наступления беременности проводили в расчете на перенос эмбрионов.

Полученные в процессе исследования данные обрабатывали c использованием программной системы Statistica for Windows версия 5.5. Сопоставление частотных характеристик качественных показателей проводили с помощью непараметрических методов χ², χ² с поправкой Йетса (для малых групп), критерия Фишера. Сравнение количественных параметров в исследуемых группах осуществляли с использованием критериев Манна—Уитни, Вальда, медианного χ² и модуля ANOVA. Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину p<0,05. Полученные данные представлены в виде средней арифметической, включая стандартное отклонение.

Пациентки в исследуемых группах статистически значимо (p>0,05) не различались по возрасту, индексу массы тела, длительности и причинам бесплодия (табл. 1).

Данные о результатах размораживания эмбрионов в исследуемых группах представлены в табл. 2.

Таким образом, метод витрификации позволил повысить выживаемость эмбрионов 5-го дня развития при сравнении с методом МЗ. Неудовлетворительные показатели выживаемости после применения метода МЗ приводили к необходимости размораживания большего количества эмбрионов в 3-й и 4-й группах.

Данные об эффективности протоколов переноса размороженных эмбрионов представлены в табл. 3.

Среднее количество перенесенных эмбрионов было достоверно выше в 1-й группе при сравнении со 2-й и 3-й группами (p<0,01). Наибольшая толщина эндометрия наблюдалась в 5-й (контроль) группе (p<0,01). Зависимости между толщиной эндометрия и наступлением беременности найдено не было. Количество переносов эмбрионов было достоверно выше в группах, где применялся метод МЗ, при сравнении с контрольной группой, а в 3-й группе при сравнении со 2-й группой (p<0,05). Анализ частоты наступления беременности в исследуемых группах показал следующее. Данный показатель достоверно не различался между 1-й и 2-й группами, а также между 3-й и 4-й группами и составил соответственно 46,34, 41,94, 31,6 и 29,5%. Частота наступления беременности в контрольной группе (51,7%) была достоверно выше при сравнении с группами, где проводился перенос размороженных эмбрионов, криоконсервированных методом МЗ (p<0,05). Подобная тенденция наблюдалась при сравнении 1-й группы с 3-й и 4-й группами. Количество пациенток с наступившей беременностью достоверно не различалось между исследуемыми группами.

Общая частота наступления беременности после переноса витрифицированных эмбрионов (44,4%) была достоверно выше при сравнении с данным показателем (30,8%) после переноса размороженных эмбрионов, криоконсервированных методом МЗ (p<0,05), и достоверно не различалась с контрольной группой (p>0,05). Таким образом, метод подготовки эндометрия — назначение ПГТ и перенос эмбрионов в МНЦ — не оказывал влияния на частоту наступления беременности после переноса размороженных эмбрионов, криоконсервированных как методом МЗ, так и методом витрификации. Однако применение метода витрификации позволило повысить частоту наступления беременности почти в 1,5 раза при сравнении с методом МЗ и добиться схожих результатов при сравнении с нативными циклами. В то время как более низкие результаты после применения метода МЗ приводили к необходимости проведения большего количества переносов эмбрионов.

Характеристика полученных беременностей представлена в табл. 4.

Несмотря на то что данные литературы [2—4] об эффективности применения метода МЗ и метода витрификации для криоконсервации эмбрионов несколько противоречивы, все же большинству авторов удалось достичь лучших результатов после переноса витрифицированных эмбрионов. В проведенных исследованиях выживаемость бластоцист после применения метода МЗ составляла 56,9—84%, частота наступления беременности — 16,7—51%. В более поздних исследованиях выживаемость бластоцист удалось повысить до 87%, частоту наступления беременности до 69,9% [5, 6]. В то время как выживаемость бластоцист после витрификации, по разным данным, находилась в пределах 72—100%, частота наступления беременности — 46,1—53% [1—4]. В исследовании, проведенном D. Zhu и соавт. [16] в 2011 г., результаты переноса витрифицированных эмбрионов на стадии бластоцисты оказались выше по сравнению с переносом нативных бластоцист. Так, частота имплантации (37%) и частота наступления беременности (55,1%) статистически значимо превышали эти показатели в контрольной группе, которые составили 25,2 и 36,4% соответственно. Таким образом, полученные результаты совпадают с данными большинства исследователей. Применение метода витрификации позволило улучшить выживаемость эмбрионов, повысить частоту наступления беременности по сравнению с методом медленного замораживания. Кроме того, удалось достичь показателей, сопоставимых с результатами переноса нативных эмбрионов.

Рядом авторов [15] было продемонстрировано, что высокая концентрация эстрогенов негативно сказывается на рецептивных свойствах эндометрия и продолжительности периода «окна» имплантации. Избыточное эстрогенное воздействие приводило к нарушению экспрессии потенциальных маркеров рецептивности эндометрия, таких как β₃-интегрин и лейкемияингибирующий фактор, а также к снижению экспрессии генов, ассоциированных с «окном» имплантации [17, 18]. По данным V. Morozov и соавт. [10], более низкая концентрация эстрогенов при использовании натурального цикла обеспечивала бо`льшую толщину эндометрия по сравнению с режимом гормональной подготовки эндометрия. Напротив, E. Chang и соавт. [12] подобного различия не получили. Однако в большом количестве исследований [19, 20] было показано, что толщина эндометрия не отражает функциональные свойства ткани. Связи между толщиной эндометрия и частотой наступления беременности в большинстве исследований также установлено не было. В настоящем исследовании толщина эндометрия была выше в контрольной группе, то есть при проведении контролируемой овариальной стимуляции. Но данное различие не оказывало влияния на исходы в исследуемых группах.

Сравнение эффективности применения различных режимов подготовки эндометрия к переносу размороженных эмбрионов показало следующее. В исследовании V. Morozov и соавт. [10] в 2007 г. частота наступления беременности была выше после переноса эмбрионов в натуральном цикле (36,7%) по сравнению с режимом ПГТ (22,9%). Для криоконсервации эмбрионов использовался метод МЗ. По данным E. Chang и соавт. [12], опубликованным в 2011 г., применение натурального цикла также приводило к повышению частоты наступления беременности (41,9%) по сравнению с ПГТ (30,4%). В настоящем исследовании использовался метод витрификации. Следует отметить, что частота наступления беременности в нашем исследовании, в особенности в группах, где проводился перенос витрифицированных эмбрионов, в большей мере соответствует данному показателю, полученному после применения более эффективного натурального цикла в выше названных исследованиях.

A. Kassab и соавт. [11] получили более высокую частоту родов (21,2%) после переноса размороженных эмбрионов в натуральном цикле при сравнении с режимом ПГТ (16,7%). Напротив, J. Konc и соавт. [8], а также M. Sathanandan и соавт. [9] достоверного различия по частоте наступления беременности между указанными режимами не установили, что совпадает с полученными нами данными. Назначение чХГ в качестве триггера овуляции в натуральном цикле приводило как к снижению частоты наступления беременности при сравнении с натуральным циклом со спонтанной овуляцией, так и к схожим результатам [12—14]. При этом назначение чХГ уменьшало число необходимых визитов пациенток [14]. Таким образом, имеющиеся данные литературы немногочисленны и противоречивы, что делает необходимыми дальнейшие исследования в этой области.

Метод витрификации является оптимальным способом криоконсервации эмбрионов 5-го дня развития. Применение метода витрификации позволяет повысить эффективность программ ВРТ с использованием криоконсервированных эмбрионов и достичь показателей, не уступающих результатам при переносе нативных эмбрионов. Применение МНЦ, хотя и не приводит к повышению частоты наступления беременности при сравнении с режимом ПГТ, позволяет уменьшить длительность приема гормональных препаратов. Перенос криоконсервированных эмбрионов в МНЦ может быть методом выбора у пациенток с сохраненным овуляторным циклом. Тем не менее необходимо дальнейшее изучение эффективности различных режимов подготовки пациенток к переносу размороженных эмбрионов и их влияния на рецептивные свойства эндометрия.