Значительная доля неудачных исходов программ вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) объясняется наличием различных генетических аномалий у эмбрионов. Наиболее распространенный метод селекции эмбрионов, основанный исключительно на морфологии, зачастую не является достаточным, поскольку даже эмбрион отличного качества может иметь неправильный набор хромосом [1, 2]. Перенос двух эмбрионов повышает результативность программ ВРТ, однако в данной ситуации не исключается возможность наступления многоплодной беременности, которая с клинической точки зрения является осложнением и увеличивает риски, которым подвергается здоровье матери и ребенка.

Преимплантационный генетический скрининг (ПГС) — метод, позволяющий повысить результативность программ ЭКО за счет селекции эмбрионов, в которых отсутствуют хромосомные аномалии. Проведение анализа возможно на разных стадиях развития. Однако диагностика эмбрионов, проводимая на полярных тельцах или на стадии дробления, имеет очевидные недостатки. В первом случае метод позволяет оценить только мейотические ошибки или хромосомные аномалии ооцита, в то время как 40% анеуплоидий эмбрион получает с отцовской стороны или они возникают в ходе митозов [3]. Во втором случае — наличие высокого уровня мозаицизма на стадии дробления (40—60%) увеличивает вероятность как ложноположительного, так и ложноотрицательного ответов [4]. Вдобавок, удаление 1—2 клеток на 6—8-клеточной стадии может снижать массу эмбриона на 12,5—25% и вероятность имплантации на 22% по сравнению с эмбрионами, которым не проводилась биопсия [5, 6].

В последние годы совершенствование технологий в ЭКО лабораториях позволило достичь высоких показателей культивирования по уровню развития бластоцист. Наряду с повышением выживаемости бластоцист при замораживании методом витрификации и вероятностью наступления беременности при переносе размороженных эмбрионов, сравнимой с таковой в нативных циклах [7], это способствовало развитию методов проведения ПГС на клетках трофэктодермы на 5—6-й день культивирования. Выбор 5—6-го дня для биопсии также имеет ряд ограничений: во-первых, не все эмбрионы in vitro достигают стадии бластоцисты, а во-вторых, необходимость замораживания эмбрионов для проведения генетического анализа может снизить вероятность наступления беременности (если в лаборатории недостаточно освоены методы витрификации). Кроме того, возможно увеличение времени до наступления беременности, поскольку перенос эмбрионов осуществляется в следующем цикле. Однако преимущества биопсии на стадии трофэктодермы существенны: большее число клеток (5—10 из 100—150, из которых состоит эмбрион на данной стадии) доступно для анализа, что позволяет практически исключить проблему мозаицизма и «самокоррекции»; клетки трофэктодермы формируют внезародышевые органы и ткани; вероятность имплантации аналогична вероятности имплантации эмбрионов, не подвергавшихся биопсии [6].

Наиболее распространенный метод ПГС, применявшийся при проведении биопсии на 3-й день развития эмбрионов, — метод FISH (fluorescent in situ hybridization) позволяет исследовать только ограниченный набор хромосом, наиболее часто встречающихся анеуплоидий (7—9 хромосом). Однако эмбрионы могут нести анеуплоидии также и по другим хромосомам, при этом до 42,8% анеуплоидных эмбрионов достигают стадии бластоцисты [8]. Метод сравнительной геномной гибридизации на микрочипах (aCGH) позволяет одновременно оценить все 24 хромосомы. Данный метод обладает высокой чувствительностью и точностью и позволяет проводить анализ по единственной клетке. Валидация метода aCGH, по данным литературы [9], показала его высокую эффективность: только для 2,9% эмбрионов результат анализа не был получен, а уровень ошибки составил 1,9%.

В клинике «АВА-ПЕТЕР» метод aCGH внедрен в практику с ноября 2012 г.

Методом аCGH проведена диагностика на 70 бластоцистах у 11 пациенток (табл. 1).

Возраст пациенток составил от 25 до 43 лет. Эмбрионы культивировали до 5-го дня, согласно стандартным протоколам лаборатории ЭКО, в индивидуальных каплях на средах фирмы «Origio» в условиях пониженного содержания кислорода (5% О₂, 6% СО₂). На 4-й день развития всем эмбрионам был выполнен вспомогательный хэтчинг с использованием лазера (Saturn, RI). В случае проведения диагностики на ранее замороженных бластоцистах эмбрионы размораживали накануне, проводили вспомогательный хэтчинг, а биопсию выполняли на следующий день, после чего повторно замораживали. На 5-й день развития на эмбрионах хорошего качества была проведена биопсия клеток трофэктодермы с использованием лазера. Эмбрионы, не достигшие соответствующей стадии развития, культивировали до 6-го дня для последующей биопсии в случаях, если она становилась возможна. Сразу после проведения биопсии все бластоцисты были заморожены методом витрификации. Дальнейшие преамплификация, амплификация, гибридизация проб и анализ результатов проводились согласно стандартному протоколу (24Sure, BlueGnome).

В клинике «АВА-ПЕТЕР» впервые в России внедрен метод aCGH для диагностики эмбрионов, полученных при помощи ВРТ.

Результат получен для 64 бластоцист (табл. 2).

Из 64 проанализированных эмбрионов 33 (51,6%) не имели численных аномалий хромосом, 22 (34,4%) эмбриона имели анеуплоидию по одной из хромосом (моно- или трисомия), у 9 (14,1%) эмбрионов отмечены многочисленные анеуплоидии.

Четырем пациенткам выполнен селективный перенос одного размороженного эмбриона после диагностики методом aCGH. В первых двух случаях клиническая беременность подтверждена при ультразвуковом исследовании (УЗИ). Третий перенос — положительный анализ чХГ. Результат последнего переноса пока неизвестен.

Первый случай беременности — пациентка 40 лет. Клинический диагноз: вторичное бесплодие, эндокринный фактор (гиперпролактинемия, ановуляция), старший репродуктивный возраст. Показанием к проведению преимплантационной диагностики методом CGH явились возраст пациентки и наличие в анамнезе спонтанного выкидыша в сроке беременности 7 нед. Контролируемую овариальную стимуляцию проводили в стандартном длинном протоколе с агонистами ГнРГ (диферелин 0,1 и гонал-Ф). В результате пункции фолликулов получено 15 ооцитов. Диагностика проведена на 9 бластоцистах. Только 3 эмбриона не имели хромосомной патологии. После переноса одного эмбриона наступила прогрессирующая беременность плодом женского пола. В настоящее время проведен УЗИ-скрининг II триместра беременности.

Второй случай беременности — пациентка 37 лет. Клинический диагноз: вторичное бесплодие, эндокринный фактор (синдром поликистозных яичников). В анамнезе у пациентки две неразвивающиеся беременности в сроке 5 и 9 нед. Контролируемую овариальную стимуляцию проводили в протоколе с антагонистами ГнРГ (оргалутран, пурегон). В качестве триггера использовали агонист ГнРГ (декапептил). В результате пункции фолликулов получено 43 ооцита. Перенос эмбрионов в лечебном цикле не производили из-за риска развития синдрома гиперстимуляции яичников.

У части эмбрионов хорошего качества на 3-й день развития проведена биопсия бластомера с последующей диагностикой методом FISH. По результатам анализа 3 хромосом (X, Y, 21) у 10 (42%) из 24 эмбрионов были выявлены анеуплоидии, 14 (58%) эмбрионов не имели численных отклонений по этим хромосомам и 9 из них достигли стадии бластоцисты и были витрифицированы.

Часть эмбрионов, на которых не проводили биопсию бластомера, культивировали до 5-го дня развития. Пять эмбрионов достигли стадии бластоцисты хорошего качества, и на них была проведена биопсия трофэктодермы с последующей aCGH.

Первый перенос размороженных эмбрионов проводили с использованием эмбрионов, диагностированных методом FISH. Для переноса были взяты 2 эмбриона хорошего качества, однако беременность не наступила.

По результатам aCGH только 2 эмбриона не имели хромосомной патологии. Один из них был перенесен в следующем цикле. На 4-й неделе после переноса биохимическая беременность была подтверждена клинически.

При проведении ПГС методом FISH на эмбрионах 3-го дня развития в нашей клинике проводится анализ хромосом 13, 14, 15, 16, 18, 21, 22, X, Y — наиболее часто встречающихся анеуплоидий, при наличии которых возможно рождение ребенка с генетической патологией, а также хромосомной патологии, наиболее часто встречающейся при неразвивающихся беременностях. Однако по результатам метода aCGH, 14 эмбрионов были анеуплоидными по другим хромосомам, и данные эмбрионы не были бы исключены при использовании стандартной методики FISH и могли быть взяты для переноса, что снизило бы результативность применения программ ВРТ.

В дальнейшем планируется накопление и анализ собственных данных.

При внедрении методики в хорошо оснащенной лаборатории, с высокими показателями результативности можно предполагать повышение эффективности программ ВРТ в группах пациенток старшего репродуктивного возраста, пациенток с несколькими предыдущими неудачными попытками ЭКО, а также при носительстве сбалансированных структурных хромосомных аномалий.