Низкая эффективность лечения больных бесплодием с использованием методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) вызывает множество негативных суждений об этих методах, как у врачей, так и у пациентов. В данном вопросе существуют субъективные и объективные факторы [2, 3]. Проведенная нами в 2011 г. оценка эффективности программы ЭКО/ИКСИ в зависимости от дня переноса эмбрионов в полость матки и показатели контролируемой индукции овуляции позволила установить, что, несмотря на зрелость бластоцист, частота наступления беременности не превышает 55% [5]. Учитывая, что 50% вероятность составляет только случайное совпадение признаков, данная величина отражает необходимость разработки методов контроля всех технологических этапов ЭКО/ИКСИ. К их числу, прежде всего, следует отнести оценку состояния зрелости эмбрионов перед переносом их в полость матки.

Существующие морфологические оценочные классификации, в том числе классификация D. Gardner [9, 10, 12], недостаточно отражают зрелость эмбриона и позволяют только выделять когорту потенциальных эмбрионов для дальнейшей селекции. Следовательно, разработка неинвазивных, воспроизводимых, стандартизованных и объективных методов оценки зрелости эмбрионов на различных стадиях дифференцировки может иметь решающее значение для существенного повышения эффективности ЭКО/ИКСИ. Отсутствие таких методов не позволяет изменить существующую эффективность ЭКО/ИКСИ. В то же время попытки оптимизации некоторых параметров технологии ЭКО/ИКСИ являются субъективными и недоказанными, значительно варьируя от одного клинического случая к другому.

Некоторую надежду на получение новых результатов дало первое, проведенное В.А. Бурлевым и соавт. в 2012 г. [1] исследование по определению содержания селектинов в культуральной среде бластомеров 3-го дня развития. Показано, что эти данные могут служить дополнительным диагностическим признаком сохранности (жизнеспособности) и функциональной активности эмбриона. Полученные результаты позволили охарактеризовать среду культивирования эмбрионов не как инертную, а как источник дополнительной информации о состоянии эмбриона.

Установлено, что раннее развитие эмбриона обеспечивается за счет материнских мРНК, полученных с яйцеклеткой. Генетически аномальные эмбрионы также могут развиваться до стадии бластоцисты за счет материнских мРНК. Собственный геном эмбриона человека может быть активирован только после 5-го дня развития [13]. Следовательно, синтез селектинов de novo у бластомеров 3-го дня культивирования осуществляется только за счет материнских мРНК. Исходя из этих положений, нами впервые было показано [1] снижение содержания селектинов в культуральной среде эмбрионов 3-го дня развития в группе больных с бесплодием и наступившей беременностью. Это свидетельствовало о том, что растворимые селектины являются маркерами процессов внутриклеточного синтеза и накопления селектинов на поверхности эмбрионов. Именно эти «тихие» эмбрионы с низким уровнем выделения селектинов накапливают их на мембранах, используя материнские мРНК, и, следовательно, их уровень ниже, чем у эмбрионов без активации этого процесса. В то же время в культуральной среде бластомеров до 3-го дня инкубации в группе больных с бесплодием и ненаступившей беременностью содержание растворимых селектинов было больше, чем у эмбрионов в группе с наступившей беременностью. Следовательно, «активные» эмбрионы не накапливают на мембранах селектины, а продуцируют их в культуральную среду, и последующий перенос таких эмбрионов в полость матки не может быть сопряжен с нидацией и имплантацией.

Полученные результаты позволили нам выдвинуть гипотезу о том, что у «тихих» эмбрионов 3-го дня инкубации низкое содержание селектинов в культуральной среде и накопление их на поверхностных мембранах позволяет участвовать в процессах взаимодействия с лигандом поверхностного эпителия эндометрия и адгезии эмбриона. Погружение растущего и дифференцирующегося трофобласта в эндометрий сопровождается началом активных преобразований цитотрофобласта эктодермального происхождения в клетки крови и клетки сосудов.

Следовательно, низкие показатели содержания L-селектина в культуральной среде 3-го дня свидетельствуют о большей вероятности наступления беременности. Можно предположить, что эти «тихие» эмбрионы обладают более высокой биологической способностью к последующему развитию, а именно к нидации и имплантации. Учитывая одинаковую морфологическую характеристику изученных эмбрионов, следует отметить информативность определения растворимых селектинов в культуральной среде 3-го дня для оценки их качества.

Проведенное нами проспективное исследование явилось наукообразующим и потребовало дальнейших работ по изучению роли селектинов в культуральной среде эмбрионов 5-го дня развития и сопоставления этих показателей с результатами 3-го дня развития.

Цель исследования — провести сравнительный анализ содержания растворимых селектинов в среде 3-го и 5-го дня культивирования эмбрионов в программах ЭКО/ ИКСИ для повышения эффективности лечения бесплодия.

Под наблюдением находились 36 женщин репродуктивного возраста от 20 до 37 лет (31,7±3,4 года), страдающих бесплодием. После проведения ЭКО/ИКСИ у 20 наступила беременность и у 16 не наступила беременность.

Критерии включения: женщины с нормальным менструальным циклом (28—32 дня), нормальным содержанием в сыворотке крови ЛГ, ФСГ, пролактина, Е2, прогестерона, тестостерона, наличием хотя бы 1 эмбриона для переноса, давшие информированное согласие на участие в исследовании после ознакомления со всеми аспектами лечения и необходимого обследования.

Критерии исключения: наличие синдрома поликистозных яичников (СПКЯ), патологии эндометрия, гидросальпинксов по данным УЗИ и гистеросальпингографии (ГСГ), астенотератозооспермии III и IV степени у мужа. Пациентки с неудовлетворительной морфологической оценкой эмбрионов также были исключены из дальнейшего наблюдения.

Дизайн исследования. Одномоментное исследование, стратифицированная рандомизация. Определение достаточности выборки осуществлялось исходя из необходимого и достигаемого в ходе исследования уровня достоверности (р<0,05).

Стимуляция овуляции. Всем женщинам проводилась стимуляция по длинному протоколу, как было описано ранее [1].

Оценка качества ооцитов, оплодотворение и культивирование эмбрионов. Полученные ооциты помещали в среду для отмывки, содержащую HEPES-буфер, а затем отмывали их в культуральной среде. Сразу после размещения ооцитов в среду для культивирования оценивали количество, качество и степень зрелости полученных комплексов oocyte—cumulus [4]. Оплодотворение ооцитов осуществлялось методами ЭКО или ИКСИ в стандартных условиях. Оценка оплодотворения проводилась по наличию мужского и женского пронуклеуса в ооците, как это было нами описано ранее [1]. Оплодотворение проходило в среде Fertilization medium (Sydney IVF), COOK, R-SIFM-20. На стадии пронуклеусов зиготы помещали в среду Cleavage medium (Sydney IVF) K-SICM-20. На 3-и сутки культивирования эмбрионы переносили в среду Blastocyst medium (Sydney IVF) K-SIFM-20, в которой они культивировались до стадии бластоцисты. Культивирование эмбрионов осуществлялось раздельно. Качество эмбрионов оценивали перед каждым переносом. Перенос осуществлялся на 3-й или 5-й день культивирования после трансвагинальной пункции яичников (ТВПЯ). При выборе дня переноса учитывалось общее состояние больной (симптомы гиперстимуляции яичников) и эмбриологические характеристики (количество эмбрионов на 3-и и 5-е сутки культивирования). Эмбрионами хорошего качества считались эмбрионы: на 2-е сутки развития, достигшие стадии 4 бластомеров и более (48 ч после трансвагинальной пункции), на 3-и сутки развития — 6 бластомеров и более. Дробящиеся эмбрионы хорошего качества имели не более 10% фрагментации. Эмбрионы, достигшие стадии бластоцисты, оценивались согласно классификации D. Gardner [9, 10, 12]. Эмбрионами удовлетворительной морфологической оценки считались 4AA, 4AB, 4BA, 5AA, 5AB, 5BA. Эмбрионы переносили в полость матки под контролем трансабдоминального ультразвука (Logic 200) c помощью катетеров Wallace («Smiths Medical International Ltd.», Объединенное Королевство) или Cook-K-Jet («Сook Ireland Ltd.», Ирландия).

Диагностика и наблюдение беременности. Биохимический тест на беременность (β-чХГ) проводили на 14—16-й день, ультразвуковую диагностику беременности осуществляли на 21-й день после переноса эмбрионов, как было описано ранее [1].

Иммуноферментный анализ. Анализ содержания L-селектина (L-selectin, L-Sel, нг/мл), P-селектина (P-selectin, P-Sel, пг/мл), E-селектина (E-selectin, E-Sel, пг/мл) в культуральной среде Cleavage medium K-SICM-20 на 3-й день и в культуральной среде Blastocyst medium K-SIBM-20 на 5-й день после ТВПЯ проводили (В.А. Бурлев и Н.А. Ильясова) с помощью иммуноферментного анализа с применением стандартных наборов (R&D systems, США). Хранение образцов, постановка реакций и расчет результатов осуществляли в стандартных условиях и согласно рекомендациям производителя. После получения аликвоты исследуемого образца к ней добавлялся витализирующий реагент, разработанный совместно с Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University (Уппсала, Швеция), и только после этого проводился иммуноферментный анализ по стандартному протоколу. Расчет содержания селектинов в культуральной среде осуществлялся исходя из числа эмбрионов.

Статистический анализ. Анализ результатов выполняли с помощью статистической компьютерной программы PASW Statistics 18. Достоверность различий полученных результатов проверялась с использованием непараметрического анализа Манна—Уитни, критерия χ², ANOVA. Результаты исследования представлены как средние ± стандартное отклонение (М±SD). Различия между группами считались достоверными при р<0,05. Для оценки информационной ценности предикторов культивирования эмбриона использовали ROC-кривые и достоверность значения р<0,05.

Характеристика обследованных больных. Все включенные в исследование больные (n=36) были разделены на две группы в зависимости от дня инкубирования эмбрионов: 3-й день (1-я группа) и 5-й день (2-я группа). В каждой из групп были выделены две подгруппы в зависимости от наступления беременности по данным биохимического теста на беременность и УЗИ: с наступившей беременностью — 20 больных (14 — в 1-й группе, 6 — во 2-й) и с ненаступившей беременностью — 16 больных (11 — в 1-й группе, 5 — во 2-й группе).

При анализе анамнестических данных показано, что средний возраст пациенток достоверно не различался и составил в 1-й группе 31,1± 4,6 года, во 2-й группе 32,8±3,6 года, длительность бесплодия была 6,6±5,0 и 8,6±4,6 года соответственно. С диагнозом бесплодия трубного происхождения в 1-й группе было 71,4% пациенток, во 2-й — 81,8%. Сочетание мужского и трубного факторов бесплодия имело место в 28,6 и 18,2% случаев соответственно в 1-й и 2-й группах. Отсутствовала беременность в анамнезе у 64,3% пациенток 1-й группы и у 54,5% пациенток 2-й группы. Больных с пролиферативными заболеваниями (полип эндометрия, гиперплазия эндометрия, эндометриоз, аденомиоз, миома) было соответственно 35,7 и 54,5%, с воспалительными гинекологическими заболеваниями — 50 и 72,7%.

Оплодотворение методом ЭКО в 1-й группе проведено у 44% пациенток, во 2-й группе — у 45,5% (р>0,05). ИКСИ использовано в 1-й группе в 56% случаев, во 2-й группе — в 54,5% (р>0,05). Показанием для ИКСИ в 1-й и 2-й группах в 53,4 и 21,3% случаев соответственно была патозооспермия (р>0,05). Количество ооцитов, полученных в ходе ТВПЯ, в 1-й группе достоверно не отличалось от их числа во 2-й группе.

Число переносимых в полость матки эмбрионов в 1-й и 2-й группах варьировало от 1 до 2 при толщине эндометрия 10,4±1,2 и 9,6±1,3 мм соответственно.

Анализ клинических данных показал отсутствие достоверных различий между группами по возрасту пациенток, особенностям репродуктивного анамнеза, фактору и длительности бесплодия, наличию в анамнезе беременностей, пролиферативных и воспалительных гинекологических заболеваний.

Содержание растворимых форм селектинов в культуральной среде эмбрионов 3-го и 5-го дней инкубирования при проведении ЭКО/ИКСИ

I этап. Результаты исследования содержания селектинов в культуральной среде бластомеров на 3-й и 5-й дни проведения ЭКО+ИКСИ в зависимости от наступления или ненаступления беременности представлены в табл. 1.

II этап. Результаты исследования содержания селектинов в культуральной среде эмбрионов на 3-й и 5-й дни проведения ЭКО в зависимости от наступления или ненаступления беременности представлены в табл. 2.

III этап. Результаты исследования содержания селектинов в культуральной среде эмбрионов на 3-й и 5-й дни проведения ИКСИ в зависимости от наступления или ненаступления беременности представлены в табл. 3.

IV этап. ROC-анализ. В связи с получением достоверных различий в содержании селектинов при инкубировании эмбрионов в течение 3 и 5 дней был проведен ROC-анализ и получена цифровая оценка ROC-кривых. Площадь под ROC-кривой (AUC) при проведении ЭКО и ИКСИ на 3-й день инкубирования эмбрионов для L-селектина составила 0,7632±0,231 и 0,782±0,193 соответственно (р<0,05), что свидетельствует о хорошем качестве полученных моделей для прогнозирования наступления беременности в зависимости от уровня L-селектина. Сравнение показателей площадей под ROC-кривой (AUC) при проведении ИКСИ на 5-й день инкубирования эмбрионов для L, P и E-селектинов показало их однородность с максимальным значением 0,811±0,112 (р<0,05) для L-селектина, что свидетельствовало об очень хорошем качестве полученной модели. Приведенные характеристики ROC-кривых доказывают важную прогностическую значимость для развития эмбриона уровня L-селектина в культуральной среде и могут быть использованы в дополнение к существующим шкалам оценки качества эмбрионов при проведении селективного переноса одного эмбриона в полость матки.

Известно, что для обеспечения жизнеспособности эмбриона при культивировании in vitro существуют три ключевые детерминанты: температура, рН и осмолярность, которые обеспечиваются специальным оборудованием и составом культуральных сред [11]. Однако in vivo эти параметры выдерживаются в строго регламентированных и эволюционно приобретенных интервалах, а in vitro такие значения могут изменяться и не контролируются с высокой точностью. Следовательно, изменение одного или нескольких параметров может приводить к температурному стрессу, рН стрессу и осмолярному стрессу [10, 17]. Изменение газовой среды культивирования также может оказывать отрицательное воздействие на жизнеспособность эмбриона. Совокупность изменений ключевых факторов метаболических детерминант и газовой среды в конечном итоге влияет на транскрипцию фактора, индуцированного гипоксией (HIF), и активирует процессы свободнорадикального окисления, приводя к гибели эмбриона [6, 14].

В идеальных условиях все культуральные среды должны включать состав солей, обеспечивающий стабильность pH и осмолярности так, чтобы ооцит/эмбрион «видел», что минимальные изменения не влияют на его состояние. Достижение таких результатов невозможно без совершенствования оборудования, обеспечивающего постоянный мониторинг ключевых детерминант и газовой среды, и при необходимости их коррекции в режимах реального времени [15, 16]. Важным компонентом контроля жизнеспособности эмбриона является уровень метаболической активности. Так, на ранних этапах развития эмбрионов in vitro и in vivo существует одинаковый принцип метаболической активности, при этом потребление кислорода резко возрастает к стадии бластоцисты [21]. Эмбрионы с высокой морфологической оценкой характеризуются низким обменом аминокислот, а нормализованный аминокислотный профиль эмбриона позволяет повысить результативность программы ЭКО [7].

Эти данные подтверждают результаты исследований C. Vergouw и соавт. [23], которые показали взаимосвязь метаболического профиля культуральной среды и жизнеспособности эмбриона.  Так, E. Seli и соавт. [18—20] рассматривают метаболические или метаболомные тест-системы оценки жизнеспособности эмбриона как многообещающие и свидетельствующие о том, что метаболическая активность может действовать как соответствующий маркер жизнеспособности эмбриона [22]. 

Начиная с 2002 г. получила развитие гипотеза «тихого» эмбриона, разработанная H. Leese [14], гласящая, что чем ниже метаболическая активность эмбриона ранней стадии развития, тем выше его жизнеспособность. К настоящему времени эта гипотеза получила дальнейшее развитие. Показано, что эмбрионы с более высоким уровнем повреждения генома, транскриптома и протеома имеют большую потребность в питательных веществах, и поэтому они метаболически более активны [6]. Одни из белков протеома — селектины играют значительную роль в процессах нидации эмбриона и дальнейшего его развития.

Полученные результаты исследования представлены на схеме

Полученные результаты позволили выделить четыре варианта содержания растворимых селектинов в культуральной среде эмбрионов и показать принципиальную возможность использования культуральной среды эмбрионов 3-го и 5-го дней инкубирования для определения в ней растворимых L, P и E-селектинов методом твердофазного иммуноферментного анализа. Максимальная концентрация среди изученных селектинов установлена для L-селектина и минимальная для Р- и Е-селектинов. Распределение данных по способу индукции оплодотворения (ЭКО или ИКСИ) показало, что для всех групп сохраняются достоверные различия между показателями L-селектина. При этом в случаях наступления беременности содержание L-селектина всегда достоверно ниже у эмбрионов 3-го дня культивирования и достоверно выше у эмбрионов 5-го дня культивирования. Эти данные имеют общебиологическое значение для понимания процессов регуляции и контроля уровня селектинов в процессе культивирования эмбрионов для отбора жизнеспособных эмбрионов и повышения эффективности программы ЭКО/ИКСИ (см. схему).

Таким образом, первое сравнительное исследование по определению содержания селектинов в культуральной среде эмбрионов 3-го и 5-го дней культивирования показало, что эти данные могут служить дополнительными диагностическими признаками их жизнеспособности и функциональной активности. Полученные результаты позволяют охарактеризовать среду культивирования эмбрионов на 3-й и 5-й дни развития как источник дополнительной информации о состоянии эмбриона. Возможность дозированного включения в состав среды культивирования бластомеров и бластоцист синтетических, рекомбинантных, природных или химерных селектинов является новым направлением в создании системы контролируемого развития эмбрионов перед переносом их в полость матки. Дальнейшие исследования в этом направлении, несомненно, принесут не только новые знания, но и новые технологии для повышения клинической эффективности метода ЭКО/ИКСИ.

Благодарности. Выражаем благодарность professor Matts Olovsson и сотрудникам Department of Women’s and Children’s Health, Uppsala University, Uppsala, Sweden за участие в обсуждениях и поддержку. Финансовая, научная, правовая и политическая помощь осуществлялась Шведской Королевской Академией наук, Шведским медицинским исследовательским советом (проект №8683), Университетом Уппсалы, Швеция, Российской академией медицинских наук, ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. В.И. Кулакова» Минздрава России.