Известно, что роль классических нейротрансмиттеров (ацетилхолина, серотонина, катехоламинов) не ограничивается их участием в передаче нервного импульса. Они могут быть эндогенными регуляторами различных клеточных процессов, в том числе и в раннем эмбриогенезе животных. Этот факт надежно установлен в работах, проведенных в основном на зародышах морских беспозвоночных [1, 2]. Однако значительно меньше известно о роли нейротрансмиттеров в эмбриогенезе млекопитающих. Имеются данные о присутствии биогенных аминов у ранних зародышей мышей и крыс [3, 4]. С помощью ингибиторного анализа с использованием антагонистов серотонина, адреналина и ацетилхолина было показано, что у доимплантационных зародышей мышей существуют структуры, чувствительные к антагонистам этих нейромедиаторов [5, 6]. Эти результаты позволили авторам предположить, что функциональная активность будущих нейромедиаторов проявляется уже на самых ранних этапах эмбриогенеза млекопитающих. Изучение влияния липофильных аналогов цАМФ на чувствительность ранних зародышей мышей к антагонистам серотонина и адреналина выявило участие цАМФ в реализации функциональной активности серотонина и адреналина в этот период развития [7, 8]. Выяснено, что серотонин принимает участие в регуляции клеточных взаимодействий и способствует выживанию зародышей в неблагоприятных условиях [9]. Показано присутствие не только самих трансмиттеров, но и всех компонентов трансмиттерных систем — рецепторов, специфических транспортеров, ферментов метаболизма [10—12]. В ооцитах и доимплантационных эмбрионах мыши выявлены β-адренорецепторы, лиганды которых обнаруживаются на ранних стадиях развития [13]. Идентифицированы α₂- и β-адренорецепторы в сперматозоидах человека и мыши и показано, что агонисты и антагонисты адренорецепторов могут влиять на процесс оплодотворения [14]. Наименее изученной остается роль в эмбриогенезе млекопитающих такого важного нейромедиатора, как дофамин. Это, отчасти, объясняется тем, что он крайне нестабилен в инкубационной среде. В некоторой степени проблему нестабильности дофамина можно разрешить с помощью его производных, а именно: амидов дофамина с жирными кислотами, относящихся к семейству ацилнейротрансмиттеров. Последние представляют собой нейротрансмиттеры, связанные амидной (дофамин, серотонин, гистамин) или эфирной связью (холин) с полиеновыми жирными кислотами. Такие соединения могут действовать как регуляторы различных биологических процессов, в том числе и процессов раннего эмбриогенеза [15—17]. Они легко проникают через клеточную мембрану и устойчивы в инкубационной среде, что позволило их использовать для изучения роли классических нейротрансмиттеров в биологических системах. Однако такие N-ацилнейротрансмиттеры обладают и собственной биологической активностью, не сводимой к активности составляющих их биогенных аминов и жирных кислот. Они присутствуют в тканях млекопитающих и других животных и обладают широким спектром действия [19, 20].

Ранее нами было испытано действие конъюгата дофамина с арахидоновой кислотой (АА-ДА) [21] на ранние стадии развития зародышей мышей. Как арахидоновая, так и докозагексаеновая кислоты играют чрезвычайно важную роль в репродукции у млекопитающих и, в частности, у мышей [22]. Чтобы установить, зависят ли наблюдаемые эффекты от структуры жирнокислотного остатка в молекуле N-ацилдофамина, или они опосредованы дофамином, мы исследовали действие конъюгата дофамина с докозагексаеновой кислотой (ДГК-ДА) на развитие доимплантационных зародышей мышей.

Опыты проводили на двух-, четырех- и восьмиклеточных зародышах мышей линии SHK. Было использовано 29 животных. Самок забивали, применяя цервикальную дислокацию. Двухклеточные зародыши вымывали из яйцеводов на 2-й день беременности, а четырех- и восьмиклеточные — на 3-й день. Зародыши инкубировали в среде М-16 («Sigma»), в которую вносили ДГК-ДА в концентрации 2 мкМ (концентрация была подобрана в предварительных опытах). Культивирование проводили в СО₂-инкубаторе («Binder», Германия) при 37 °С в атмосфере 5% СО₂. За развитием наблюдали с помощью стереоскопического микроскопа с термостатическим столиком Leica DM JL (Германия). Фотосъемку производили с помощью инверсионного микроскопа Axiovert 200, «Zeiss» (Германия). Культивирование продолжали до достижения зародышами контрольной группы (интактный) конечной стадии доимплантационного развития — бластоцисты. Наблюдения проводили каждые 24 ч. Всего в опытах было использовано 173 зародыша.

Состояние зародышей оценивали по их морфологии, а также по соответствию стадии развития и времени, прошедшему с момента оплодотворения [23]. Полученные результаты представлены в виде среднего ± стандартная ошибка. Достоверность результатов оценивали по t-критерию Стьюдента, используя модифицированную программу Microsoft Exсel, которая вычисляет стандартную ошибку для малых выборок. Статистически достоверными считали значения при p<0,05.

Через 24 ч культивирования в контрольной и в опытной группах большинство зародышей находилось на стадии 4 бластомеров (рис. 1, а).

Таким образом, эти наблюдения показывают, что ДГК-ДА не препятствует начальным процессам дробления двухклеточных зародышей, но отрицательно влияет на последующие процессы и прежде всего на процесс компактизации, начинающейся на стадии 8 бластомеров.

Сравнение развития контрольных и подопытных зародышей при внесении ДГК-ДА на стадии 4 бластомеров показывает, что через 24 ч культивирования большинство контрольных и подопытных зародышей находилось на стадии 8 компактных бластомеров. Часть контрольных зародышей была на следующей стадии развития — многоклеточной морулы. Среди подопытных зародышей таких морул не было обнаружено (рис. 3, а).

Через 48 ч культивирования в опыте стадии бластоцисты достигли в 2 раза меньше зародышей, чем в контроле (см. рис. 3, б). Многие подопытные зародыши имели аномальное строение и представляли собой плотные скопления крупных клеток. Клетки, расположенные на поверхности таких зародышей, имели вид прозрачных пузырьков; по-видимому, это дифференцирующиеся серповидные клетки трофобласта (рис. 4).

Эти данные показывают, что в присутствии ДГК-ДА развитие четырехклеточных зародышей до стадии 8 компактных бластомеров не отличается от развития контрольных зародышей, однако на последующих стадиях нарушается формирование многоклеточной морулы, а затем и бластоцисты.

Через 24 ч культивирования в контроле большая часть зародышей находилась на стадии многоклеточной морулы и на стадии бластоцисты, а в опыте — на стадии 8 компактных бластомеров и многоклеточной морулы (рис. 5, а).

Сопоставление данных, полученных на зародышах разных стадий дробления, позволяет выявить особенности действия ДГК-ДА на раннее развитие мышей in vitro.

ДГК-ДА не препятствует продолжению дробления двухклеточных зародышей, которые проходят два раунда деления и достигают стадии 8 бластомеров. Однако на этой стадии у них нарушается процесс компактизации.

Четырехклеточные зародыши после помещения в среду, содержащую ДГК-ДА, успешно проходят одно деление и приступают к компактизации. На стадии 8 компактных бластомеров у них происходит задержка развития, и зародыши медленнее, чем в контроле, переходят на стадию многоклеточной морулы. В дальнейшем, через 48 ч проявляются нарушения в процессах формирования бластоцисты, что приводит к большому количеству аномальных зародышей.

Подопытные восьмиклеточные зародыши в первые 24 ч культивирования успешно развиваются до стадии морулы, однако у них замедляется переход на стадию бластоцисты. Наблюдаемый значительный процент зародышей с аномалиями строения также говорит о негативном влиянии ДГК-ДА на процесс формирования бластоцисты. Это подтверждается и результатами наблюдения над состоянием зародышей через 48 ч культивирования: стадии бластоцисты в опыте достигает значительно меньшее количество зародышей, чем в контроле. Следует отметить, что во всех группах подопытных зародышей в результате действия ДГК-ДА резко уменьшается количество бластоцист, имеющих нормальное строение, и увеличивается количество аномальных зародышей. Эти данные согласуются с предположением о важности каждой стадии раннего дробления для формирования бластоцисты [24].

Представленные результаты показывают, что ДГК-ДА действует по-разному в зависимости от стадии, на которой находятся зародыши в момент его внесения. Так, ДГК-ДА не останавливает дробления двухклеточных зародышей, но нарушает следующий процесс — начало компактизации на стадии 8 бластомеров. ДГК-ДА не прерывал деление четырехклеточных зародышей и их компактизацию на стадии 8 бластомеров, но подавлял следующий процесс — формирование многоклеточной морулы. У восьмиклеточных зародышей в присутствии ДГК-ДА проходят процессы компактизации и образование морул, но нарушается процесс формирования бластоцист. Можно сделать вывод, что действие ДГК-ДА не нарушает протекание какой-то определенной стадии, но мешает переходу на следующую.

Сравнение эффектов ДГК-ДА и АА-ДА показывает кардинальное различие в действии этих N-ацилдофаминов. При внесении в концентрации 2 мкМ на стадии 2 бластомеров АА-ДА в значительной степени подавлял дробление [21], в то время как ДГК-ДА в аналогичной концентрации не влиял на этот процесс. Если бы активным компонентом был остаток дофамина, то эффекты обоих веществ были бы схожи. С другой стороны, следует отметить, что N-ацилдофамины подвергаются гидролизу лишь в незначительной степени [25], поэтому маловероятным представляется появление в инкубационной среде значительного количества свободной жирной кислоты. Логично предположить, что наблюдаемый эффект ДГК-ДА связан с активностью цельной молекулы. Существует предположение, что 3-гидрокситирамиды, к которым относятся ДГК-ДА и АА-ДА, могут быть универсальными эндогенными регуляторами раннего эмбриогенеза, что было показано на зародышах морских беспозвоночных [16].

Полученные данные о действии ДГК-ДА представляют интерес для анализа механизмов раннего развития млекопитающих. Как известно, подготовительные процессы, обеспечивающие достижение новой стадии, начинаются гораздо раньше, чем появляются первые морфологические признаки, характерные для каждого нового состояния зародыша [26]. Существует точка зрения [24], что в доимплантационном периоде развития жестко детерминирована последовательность событий, и запуск очередной стадии на ранних этапах морфогенеза млекопитающих может начаться лишь после того, как достигнут определенный «критический» уровень концентрации продуктов, синтезированных на предшествующей стадии и необходимых для последующей. При этом важным для возможности морфогенетических переходов является, по-видимому, и возникновение определенного набора стадиеспецифических факторов, служащих сигналом к дальнейшему развитию [27].

Особенности обнаруженного действия ДГК-ДА на раннее развитие зародышей мышей согласуются с вышеизложенным представлением о том, что этот процесс состоит из последовательных стадий, запуск которых обусловливается событиями, совершающимися в определенный момент на более ранней стадии.

Наши данные позволяют также предположить, что на каждой стадии доимплантационного развития идут независимые друг от друга процессы, направленные на реализацию различных задач: одни обеспечивают полное завершение протекающей стадии, другие — включают механизмы, необходимые для перехода и прохождения последующей. Сравнение действия АА-ДА и ДГК-ДА показывает, что, по-видимому, АА-ДА активно вмешивается в процессы текущей стадии морфогенеза, тогда как ДГК-ДА воздействует на процессы, которые детерминируют следующую стадию развития, но не мешает завершению уже происходящих морфогенетических событий. В настоящее время недостаточно данных, чтобы установить, насколько эти эффекты ацилдофаминов могут реализовываться in vivo. АА-ДА надежно идентифицирован только в нервных тканях млекопитающих [28], а ДГК-ДА — только в пресноводной гидре [29]. Однако можно предположить, что нейротрансмиттер дофамин в виде амидов с арахидоновой и докозагексаеновой кислотами может вмешиваться в протекание стадий доимплантационного развития, выступая в роли отрицательного регулятора.

Работа поддержана грантом РФФИ 11-04-01469а.