Исследование анеуплоидий хромосом Х, Y, 18, 21 в ядрах сперматозоидов у мужчин с астено- и олигоастенозооспермией

При лечении методами вспомогательной репродуктивной технологии необходимо учитывать тот факт, что генетика эмбриона зависит от качества как ооцита, так и сперматозоида [1]. Отклонения спермограммы пациента от нормы (астено-, олиго-, тератозооспермия) могут свидетельствовать о наличии численных или структурных хромосомных патологий в ядрах сперматозоидов. Исследование ядер сперматозоидов пациентов с астено-, олиго- или тератозооспермией при лечении бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) является необходимым этапом обследования для выбора дальнейшей тактики лечения с целью назначения, в случае необходимости, преимплантационной диагностики перед переносом эмбрионов [2].

Цель настоящей работы — исследование наличия анеуплоидий хромосом Х, Y, 18, 21 в ядрах сперматозоидов с помощью метода флюоресцентной гибридизации in situ (FISH) у пациентов с двумя и более безуспешными попытками ЭКО. Показанием для данного анализа являлись такие отклонения в спермограмме пациентов, как астено- и олигоастенозооспермия [3].

В ходе обследования перед программой ЭКО был проведен анализ с целью выявления численных аномалий для хромосом Х, Y, 18 и 21 в ядрах сперматозоидов методом FISH у 52 пациентов: 12 — с олигоастенозооспермией и 40 — с астенозооспермией. Средний возраст пациентов составил 41±3,5 года. В случае олигоастенозооспермии анализ был проведен только в том случае, если концентрация сперматозоидов составляла не менее 2 млн/мл.

С целью проведения протокола FISH сперматозоиды были отмыты с помощью PBS (phosphate buffer saline, «Sigma») и зафиксированы в смеси 96% этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3:1. Зафиксированный препарат в течение 12—14 ч выдерживали при –20 °С. Для дальнейшей подготовки препарата были использованы 70, 90 и 96% этанол. После высыхания на предметное стекло с препаратом для дальнейшей гибридизации были добавлены ДНК-зонды CEP Y (DYZ3) Satellite  DNA SpectrumOrange, CEP X (DXZ1) Alpha Satellite  DNA SpectrumGreen, CEP 18(D18Z1) Alpha Satellite DNA SpectrumAqua, LSI 21 (loci D21S259, D21S341, D21S342, region 21q22.13-q22.2) SpectrumOrange («Vysis-Abbott», США). Для инициации гибридизации препарат с добавленными ДНК-зондами был в течение 10 мин выдержан при температуре 75 °С. Последующая инкубация занимала 5 ч при температуре 42 °С [4—6]. Анализ флюоресцентного сигнала был проведен с помощью флюоресцентного микроскопа Nikon Eclipse 80i. Результат был задокументирован с помощью цитогенетической программы Lucia Karyo (LIM, Чехия).

Содержание анеуплоидий в ядрах сперматозоидов не превысило 0,2% у 14 (26,9%) пациентов: у 2 (16,7%) — с олигоастенозооспермией и 12 (30%) — с астенозооспермией. Содержание анеуплоидий в ядрах сперматозоидов превысило 1,0% у 38 (73,1%) пациентов: у 10 (83,3%) — с олигоастенозооспермией, у 28 (70%) — с астенозооспермией. Данные о частоте встречаемости анеуплоидий по исследуемым хромосомам представлены на рис. 1.

Настоящее исследование подтверждает необходимость проведения анализа анеуплоидий в ядрах сперматозоидов методом FISH по хромосомам 18, 21, X, Y у пациентов с астено- и олигоастенозооспермией. При этом частота численных хромосомных аномалий в ядрах сперматозоидов в 1,8 раза выше у пациентов с олигоастенозооспермией, чем у пациентов с астенозооспермией (р<0,05). Поэтому данный анализ необходимо рассматривать как обязательный тест при обследовании пациента с олигозооспермией перед программой ЭКО. Наличие 1,0% и более аномальных сперматозоидов у пациента является показанием к проведению преимплантационной генетической диагностики перед переносом эмбрионов.