В последние годы в различных популяционных и возрастных группах отмечается рост числа больных сахарным диабетом 2-го типа (СД2) [1].

По данным государственного регистра сахарного диабета, в 2016 г. в Кыргызстане зарегистрирован 5571 новый случай СД, из них СД1 впервые выявлен у 72 детей и у 146 взрослых и подростков, СД2 выявлен у 5353 взрослых и у 1 ребенка. Первичная заболеваемость СД1 среди детей составила 3,96, а среди взрослых 3,53 на 100 тыс. населения. Особенно высокие показатели заболеваемости, как и во всех других странах, выявлены для СД2 (129,4 на 100 тыс. населения), что подтверждает эпидемический характер данного типа сахарного диабета [2].

В настоящее время в патогенезе СД2 все большее внимание уделяется генетическим факторам риска [3, 4]. Предрасположенность к СД2 определяется структурным и функциональным состояниями множества генов, в том числе генов KCNJ11 (АТФ-зависимый калиевый канал), адипонектина (ADIPOQ), оментина, лептина, TCF7L2 (транскрипционный фактор 7, подобный второму) и PPARg (гамма-рецептор, активируемый пролифератором пероксисом), продукты которых участвуют на различных этапах метаболизма углеводов и жиров, влияют на чувствительность тканей к инсулину и функционирование β-клеток поджелудочной железы [3, 4].

Гены KCNJ11, ADIPOQ, оментина, лептина, TCF7L2 и PPARg, как и большинство других генов, имеют полиморфные участки, обусловленные нуклеотидными заменами первичной нуклеотидной последовательности ДНК [4, 5]. Согласно результатам клинических и экспериментальных исследований, различные варианты полиморфных локусов Glu23Lys гена KCNJ11, G276T гена ADIPOQ, Val109Asp гена оментина, G2548A гена лептина, IVS3C/T гена TCF7L2 и Pro12Ala гена PPARg могут определять межиндивидуальные различия наследственной предрасположенности к СД2 [4—6].

Известно, что каждая популяция имеет свой специфический набор генотипов и аллелей, а также характеризуется определенным типом питания и образом жизни. В этой связи результаты молекулярно-генетических исследований, касающиеся ассоциации вариантов полиморфных локусов с многофакторными заболеваниями, полученные на одной популяции, далеко не всегда совпадают с данными, полученными на других этнических группах. Для выявления генетических маркеров повышенного риска развития СД2 целесообразно исследовать каждую популяцию в отдельности. Кроме того, предрасположенность к СД2 как к генетически гетерогенному заболеванию возникает в результате сочетанного эффекта нескольких генов, в связи с чем при прогнозировании риска развития СД2 необходимо учитывать межгенные взаимодействия.

Цель исследования — изучить межгенные взаимодействия и вклад полиморфных локусов генов KCNJ11, ADIPOQ, оментина, лептина, TCF7L2 и PPARg в развитие СД2 в кыргызской популяции.

В исследование включены 223 пациента кыргызской национальности, из них 114 — больные СД2 (53 женщины и 61 мужчина, средний возраст 54± 7,4 года), находившихся на стационарном лечении в отделении общей терапии национального Центра кардиологии и терапии Бишкека (Кыргызская Республика) в период 2014—2015 гг. СД2 диагностировали в соответствии с критериями ВОЗ (1999). Контрольную группу составили 109 практически здоровых лиц (48 женщин и 61 мужчина, средний возраст 50±8,4 года). Все участники подписали информированное согласие на проведение молекулярно-генетических исследований. Исследование одобрено локальным этическим комитетом НИИ молекулярной биологии и медицины Бишкека.

Выделение ДНК из лейкоцитов периферической крови осуществлялось стандартным фенол-хлороформным методом. Генотипирование полиморфных локусов генов проводилось методом ПЦР-ПДРФ анализа. Продукты амплификации и рестрикции анализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле и гельдокументирующей системы (GelDoc-IT, UVP).

Для амплификации полиморфного локуса Glu23Lys гена KCNJ11 использовались праймеры: 5’-GACTCTGCAGTGAGGCCCTA-3’ и 5’-ACGTTGCAGTTGCCTTTCTT-3’. ПЦР продукты амплификации обрабатывались эндонуклеазой Ban II (рис. 1).

Для амплификации полиморфного локуса G276T гена ADIPOQ использовались праймеры 5’-GGCCTC-TTTCATCACAGACC-3’ и 5’-AGATGCAGCAAAGCCAAAGT-3’ и рестриктаза BsmI (рис. 2).

Идентификация генотипов полиморфного локуса Val109Asp гена оментина проводилась с использованием праймеров: прямого 5’-GAGCCTTTAGGCCATGTCTCT-3’ и обратного 5’-CTCTCCTTCTTCTCCAGCCCAT-3’. Для идентификации генотипов ПЦР продукты амплификации обрабатывались эндонуклеазой AccI (рис. 3).

Амплификация полиморфного локуса G2548A гена лептина проводилась с использованием праймеров: прямого 5’-TTTCCTGTAATTTTCCCGTGAG-3’ и обратного 5’-AAAGCAAAGACAGGCATAAAAA-3’. Для идентификации генотипов ПЦР продукты амплификации обрабатывались эндонуклеазой CfоI (рис. 4).

Генотипы полиморфного локуса IVS3C/T гена TCF7L2 идентифицировались с использованием праймеров: прямого 5’-ACAATTAGAGAGCTAAGCACTTTTTAAATA-3’ и обратного 5’-CTAACCTTTTCCTAGTTATCTGACATTG-3’. ПЦР продукты амплификации обрабатывались эндонуклеазой SspI (рис. 5).

Для амплификации полиморфного локуса Pro12Ala гена PPARg использовались праймеры: прямой 5’-GCCAATTCAAGCCCAGTC-3’ и обратный 5’-GA-TATGTTTGCAGACAGTGTATCAGTGAAGGAATCGCTTTCCG-3’. После проведения ПЦР продукты амплификации обрабатывались эндонуклеазой BstUI (рис. 6).

Статистическая обработка результатов исследования проведена с помощью пакета программы GraphPad Prism v5 [http://www.graphpad.com/]. Для качественных данных определяли частоты встречаемости в процентах. Для нахождения различий между качественными показателями использовали метод χ² с поправкой Йетса на непрерывность с построением таблиц сопряженности. Силу ассоциации выражали в значениях отношения шансов (OR) с 95% доверительным интервалом (95% CI). Ассоциацию расценивали как отрицательную при OR <1 («фактор устойчивости»); нейтральную (отсутствующую) при OR =1 и положительную при OR >1 («фактор риска»).

Межгенные взаимодействия изучали с помощью метода Multifactor Dimensionality Reduction (MDR 3.0.2) и его модифицированной версии GMDR (Generalized Multifactor Dimensionality Reduction). Среди всех мультилокусных моделей выбирали модель с наименьшей ошибкой предсказания и наивысшей воспроизводимостью. За критический уровень статистической значимости принимался р<0,05.

В настоящее время выявлено множество генетических локусов, ассоциированных с СД2, причем в разных популяциях развитие СД2 может быть обусловлено эффектами разных генетических локусов. Мы выбрали локусы генов KCNJ11, ADIPOQ, оментина, лептина, TCF7L2 и PPARg, показавших в отдельных популяциях статистически значимую ассоциацию с СД2 [5—7]. В табл. 1 представлены

При анализе распределения генотипов и аллелей полиморфного локуса Glu23Lys гена KCNJ11 выявлена более высокая частота встречаемости аллеля 23Lys в группе больных СД2 (44%), чем в контрольной группе (33%; χ² =5,54, р=0,019). У носителей аллеля 23Lys риск развития СД2 в 1,62 раза превышал таковой у носителей аллеля Glu23 (OR=1,62, CI 95% 1,10—2,38; p=0,019). Таким образом, в популяции кыргызов аллель 23Lys гена KCNJ11 является аллелью повышенного риска СД2, а аллель Glu23 и генотип Glu23Glu, напротив, оказывают протективный эффект.

Ген ADIPOQ кодирует белок адипонектин, который активно участвует во многих обменных процессах организма, включая углеводный обмен. Адипонектин поддерживает уровень глюкозы в скелетных мышцах и печени путем повышения чувствительности тканей к инсулину [6]. Исследование полиморфного локуса G276T гена ADIPOQ выявило ассоциацию гетерозиготного генотипа G276T (χ²=6,65; р=0,036) и аллеля 276T с повышенным риском СД2 (χ²=5,008; р=0,025). При наличии гетерозиготного генотипа G276T риск развития СД2 увеличивается в 1,79 раза (OR=1,79, CI 95% 1,05—3,05; p=0,036), а аллеля 276T — в 1,68 раза (OR=1,68, CI 95% 1,09—2,60; p=0,025). Таким образом, в кыргызской популяции гетерозиготный генотип G276T и аллель 276T полиморфизма G276T гена ADIPOQ могут быть определены как генетические предикторы, тогда как распространенный генотип G276G и аллель G276 — как протекторы развития СД2.

Что касается полиморфных локусов Val109Asp гена оментина, G2548A гена лептина, IVS3C/T гена TCF7L2 и Pro12Ala гена PPARg, то частота встречаемости генотипов и аллелей изученных полиморфизмов в группе СД2 и в группе контроля статистически значимо не различалась. Таким образом, в популяции кыргызов эти полиморфные локусы указанных генов, взятые в отдельности, не были ассоциированы с СД2.

Учитывая, что фенотип СД2 как генетически гетерогенного заболевания, определяется не одним геном, а определенными комбинациями генотипов и аллелей разных генов, мы провели анализ межгенных взаимодействий с целью выявления наиболее значимых из них. В анализ были включены все полиморфные варианты изученных генов вне зависимости от ранее найденных или отсутствующих ассоциаций. Причина использования данной стратегии заключалась в том, что при одновременном анализе вклада двух и более полиморфных вариантов в развитие СД2 может быть выявлена ранее не вскрытая закономерность, тогда как вклад однонуклеотидных полиморфизмов по отдельности может не иметь решающего значения. Анализ межгенных взаимодействий проводили с помощью программного обеспечения MDR (http://www.multifactordimensionalityreduction.org/) и его модифицированной версии GMDR (www.healthsystem.virginia.edu/internet/addictiongenomics/Software). Использовались алгоритмы полного и принудительного поиска (Exhaustive search algorithm/ Forced search algorithm). Алгоритм полного поиска оценивал все возможные сочетания генотипов в отношении риска развития СД2. В тех случаях, когда этот алгоритм не позволял выявить статистически значимое взаимодействие локусов, мы использовали алгоритм Forced, на основании которого для создания n-локусных комбинаций маркеров вручную выбирались генные локусы, которые на предыдущих этапах анализа показали вовлеченность в развитие СД2 (табл. 2).

В результате были выявлены семь статистически значимых — двух-, трех-, четырех-, пяти- и шестилокусных моделей со 100% воспроизводимостью (Cross validation consistency — 10/10), определяющих предрасположенность к СД2 в кыргызской популяции (см. табл. 2). Во всех моделях межгенных взаимодействий присутствует ген ADIPOQ, продукт которого непосредственно принимает участие в повышении чувствительности тканей к инсулину [5, 6], что свидетельствует о важности инсулинорезистентности как ключевого звена патогенеза СД2 и несомненном вкладе гена ADIPOQ в развитие данного заболевания.

Среди всех n-локусных моделей наибольшей точностью предсказания (79%) и наименьшей ошибкой предсказания (0,203) обладает 6-локусная модель, включающая все анализируемые полиморфные варианты исследуемых генов. Для 6-локусной модели с помощью программы MDR построена радиальная диаграмма (рис. 7),

При анализе определения величины информации для каждого гена в отдельности было показано, что полиморфные варианты изученных генов влияют на фенотипическое проявление СД2 с неодинаковой силой. Так, наибольший вклад в развитие СД2 вносят гены ADIPOQ (2,17%) и KCNJ11 (2,01%). Что касается изученных полиморфизмов остальных генов, то их вклад в развитие СД2 в отдельности был не столь существенным и составил от 0,53 до 0,16%. Таким образом, гены оментина, лептина, TCF7L2 и PPARg имеют низкий прогностический потенциал в отношении риска развития СД2 в кыргызской популяции. Полученные данные согласуются с результатами монолокусного анализа, показавшего ассоциацию генов ADIPOQ и KCNJ11 с СД2 и в отдельности.

Исследование генетической компоненты актуально для выявления генетических предикторов развития СД2. Кандидатами на эту роль рассматриваются гены KCNJ11, ADIPOQ, оментина, лептина, TCF7L2 и PPARg, продукты которых участвуют в метаболизме углеводов и липидов, в повышении чувствительности тканей к инсулину и функционировании β-клеток поджелудочной железы [5, 7, 8].

Ген KCNJ11 расположен на хромосоме 11 в области р15.1 и кодирует белок Kir6.2, входящий в состав АТФ-зависимого К⁺-канала β-клеток [8]. В гене KCNJ11 выявлено несколько полиморфных участков [8]. Наиболее полно изучен полиморфизм Glu23Lys, вариантный аллель 23Lys которого, по данным литературы [9—16], ассоциирован с СД2 у китайцев, японцев, корейцев, русских, англичан, тунисцев, тайваньцев, иранцев.

В кыргызской популяции частота встречаемости аллеля 23Lys гена KCNJ11 у больных СД2 была повышена (χ²=5,54; р=0,019), увеличивая тем самым риск развития данной патологии в 1,62 раза. Таким образом, аллель 23Lys гена KCNJ11 является предиктором развития СД2 как в азиатских, так и в европейских популяциях. Ассоциация полиморфного маркера Glu23Lys гена KCNJ11 с СД2 обусловлена тем, что замена глутаминовой кислоты на лизин в 23-м положении белка Kir 6.2 приводит к снижению секреции инсулина вследствие повышения активности АТФ-зависимого ионного канала, изменению мембранного потенциала и уменьшению концентрации внутриклеточного кальция, инициирующего секрецию инсулина [9, 10, 13].

Ген ADIPOQ картирован на хромосоме 3q27 и кодирует белок адипонектин [17]. Одним из главных функций адипонектина является снижение инсулинорезистентности за счет повышения чувствительности скелетных мышц и печеночной ткани к инсулину путем стимуляции фосфорилирования тирозина (рецептора инсулина) [17, 18]. Ген ADIPOQ состоит из 3 экзонов и 2 интронов. Во втором интроне этого гена имеется полиморфный участок G276T, который у представителей ряда этнических групп ассоциирован с СД2 [5, 6, 17, 18]. В нашем исследовании локус G276T гена ADIPOQ также был ассоциирован с СД2. В кыргызской популяции маркером повышенного риска СД2 является гетерозиготный генотип G276T (χ²=6,65; р=0,036) и аллель 276T (χ²=5,008; р=0,025) гена ADIPOQ. Исходя из функций адипонектина, можно предположить, что ассоциация полиморфного локуса G276T гена ADIPOQ с СД2 связана с нарушением чувствительности тканей к инсулину [5, 17, 18].

Ген оментина локализован на хромосоме 1 в локусе 1q22—q23 и кодирует экспрессирующийся преимущественно жировой тканью белок, который участвует во многих метаболических процессах, в том числе в метаболизме углеводов и липидов [19, 20]. В литературе практически нет данных относительно взаимосвязи полиморфизма Val109Asp гена оментина с СД2. Имеются сообщения [21—23] об ассоциации редкого генотипа Val109Val этого гена с абдоминальным ожирением и коронарной болезнью сердца, а также связи аллеля Val109 с раком молочной железы. По результатам нашего исследования, полиморфный локус Val109Asp гена оментина не ассоциирован с СД2, так как его вклад в развитие СД2 составил всего 0,53%. В то же время данный ген входил в 3-, 5- и 6-локусные модели межгенных взаимодействий, формирующих предрасположенность к СД2.

Ген лептина, расположенный на 7-й хромосоме в сегменте 31.3, кодирует синтезирующийся преимущественно клетками белой жировой ткани многофункциональный белок лептин. Большинство функций лептина связаны с механизмами регуляции потребления пищи и расходом энергии [24]. Наиболее изучен полиморфный локус гена лептина — G2548A, который ассоциирован с множеством фенотипов, включая ожирение, гиперлипидемию [25], инсулинорезистентность [26] и СД2 [27]. У египтян не выявлена ассоциация полиморфного локуса G2548A гена лептина с СД2 [28]. В нашем исследовании вклад этого локуса в развитие СД2 оказался слабым (0,34%), однако обнаружен умеренный синергический эффект между геном лептина и ADIPOQ в отношении риска развития СД2 (0,68%.) Это, возможно, обусловлено тем, что лептин и адипонектин являются специфическими для жировой ткани белками, тогда как оментин, который также экспрессируется жировой тканью, не является специфическим для нее [20].

T-клеточный транскрипционный фактор 4, кодируемый геном TCF7L2, является составной частью Wnt-сигнального пути, который играет важную роль в делении и дифференцировке β-клеток поджелудочной железы и связан с секрецией инсулина [29, 30]. Наиболее изученным полиморфизмом гена TCF7L2 является IVS3C>T rs7903146 [30]. Известно, что вариант аллеля IVS3-T локуса IVS3C/T гена TCF7L2 является значимым фактором риска развития СД2 в европейских популяциях [30—32]. Азиатские и европейские популяции заметно различаются по частоте встречаемости аллеля IVS3-T полиморфизма IVS3C/T гена TCF7L2. В азиатских популяциях встречаемость этого аллеля меньше (5—15%), чем в европейских (36—46%). У населения Африки она доходит до 50% [33]. В кыргызской популяции частота встречаемости аллеля IVS3-Т локуса IVS3C/T гена TCF7L2 составила 11%, что значимо не отличается от соответствующего показателя в других азиатских популяциях [34, 35].

В отличие от европейцев, в азиатских популяциях полиморфный локус IVS3C/T гена TCF7L2 в отдельности либо слабо ассоциирован с СД2, либо вообще не ассоциирован с ним [34, 36, 37]. Это, вероятнее всего, обусловлено различиями в частоте встречаемости аллеля IVS3-T в азиатских и европейских популяциях, а также этнической специфичностью наследственной архитектуры СД2 и ген-генных и/или ген-средовых взаимодействий наследственной составляющей СД2 в этих популяциях.

Ген PPARg, локализованный на 3 хромосоме (3p25), кодирует внутриклеточный транскрипционный фактор, регулирующий экспрессию генов, продукты которых связаны с аккумуляцией жира, дифференцировкой адипоцитов, а также с чувствительностью тканей к инсулину [38]. Наиболее изученным генетическим полиморфизм в этом гене, ассоциированным с СД2, является Pro12Ala [39, 40]. Найденная ранее некоторыми группами исследователей ассоциация с СД2 полиморфного маркера Pro12Ala гена PPARg не была подтверждена нами на выборке больных кыргызской популяции. Схожие результаты были получены и при исследовании других популяций. Так, M. Fu и соавт. [41] не нашли ассоциации этого полиморфного локуса с СД2 у китайцев. У индусов локус Pro12Ala гена PPARg также не был ассоциирован с СД2 [42].

Среди изученных шести генов наибольший вклад в развитие СД2 вносят полиморфные локусы G276T гена ADIPOQ (2,17%) и Glu23Lys гена KCNJ11 (2,01%). Маркерами повышенного риска развития СД2 в кыргызской популяции являются аллель 276T и гетерозиготный генотип G276T гена ADIPOQ, а также аллель 23Lys гена KCNJ11.

Полиморфные локусы генов оментина (Val109Asp), лептина (G2548A), TCF7L2 (IVS3C/T) и PPARg (Pro12Ala) по отдельности в развитие СД2 вносят не столь существенный вклад, а их участие в фенотипической реализации СД2 осуществляется за счет ген-генного взаимодействия. При анализе межгенных взаимодействий выявлены статистически значимые двухлокусные (ADIPOQ, лептин), трехлокусные (ADIPOQ, KCNJ11, TCF7L2; ADIPOQ, KCNJ11, PPARg; ADIPOQ, оментин, PPARg), четырехлокусные (ADIPOQ, KCNJ11, TCF7L2, PPARg), пятилокусные (ADIPOQ, оментин, лептин, TCF7L2, PPARg) и шестилокусные (ADIPOQ, KCNJ11, оментин, лептин, TCF7L2, PPARg) модели межгенных взаимодействий, определяющие предрасположенность к СД2 в кыргызской популяции. Результаты анализа роли каждого гена в отдельности и в комбинации с другими генами свидетельствуют о существенной роли гена ADIPOQ в формировании повышенного риска к СД2 в популяции кыргызов.

Идентификация генетических предикторов развития СД2 с учетом этнической принадлежности имеет важное значение для выявления лиц с повышенным риском развития данного заболевания, что позволяет своевременно провести среди них комплекс профилактических мероприятий, направленных на снижение заболеваемости СД2 как в семьях с отягощенным по сахарному диабету анамнезом, так и в общей популяции.

Источник финансирования. Работа выполнена при финансировании Министерства Образования и Науки Кыргызской Республики (№ госрегистрации 0007164 от 13 марта 2015).

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие явных и потенциальных конфликтов интересов, связанных с публикацией настоящей статьи.

Участие авторов: Концепция и дизайн исследования — А.А. Алдашев, Э.М. Миррахимов; генотипирование —, Э.T. Талайбекова Б.Ж. Жыргалбекова; анализ полученных данных, написание текста — Ж.Т. Исакова, Н.М. Алдашева; редактирование рукописи. Все авторы внесли существенный вклад в проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией.

Сведения об авторах

*Исакова Жайнагуль Толоновна — д.м.н. [Zhainagul Т. Isakova, MD, PhD]; адрес: Кыргызская Республика, 720040, Бишкек, ул. Тоголок Молдо, 3 [address: 3 Togolok Moldo street, Bishkek, 720040, Kyrgyz Republic]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-3681-6939; eLibrary SPIN: 2489-8031; e-mail: jainagul@mail.ru

Талайбекова Эльнура Талайбековна — [Elnura T. Talaibekova]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-4619-1928; eLibrary SPIN: 5722-1198; e-mail: elya-1209@mail.ru

Жыргалбекова Бактыгуль Жыргалбековна — [Baktygul Zh. Zhyrgalbekova]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-0855-9450; eLibrary SPIN: 6738-1297; e-mail: happyflower7@mail.ru

Миррахимов Эркин Мирсаидович — д.м.н., проф. [Erkin M. Mirrakhimov, MD, PhD, Professor]; ORCID: http://orcid.org/0000-0003-2982-6108; e-mail: erkmirr@gmail.com

Алдашева Назира Мирсаидовна — д.м.н. [Nazira M. Aldasheva, MD, PhD]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-0356-9118; eLibrary SPIN: 2633-7587; e-mail: aldashev@gmail.com

Алдашев Алмаз Абдулхаевич — д.б.н., акад. НАН КР [Almaz A. Aldashev, MD, PhD, Professor]; ORCID: http://orcid.org/0000-0002-4793-2206; e-mail: aldashev@gmail.com