Сайт издательства «Медиа Сфера»
содержит материалы, предназначенные исключительно для работников здравоохранения. Закрывая это сообщение, Вы подтверждаете, что являетесь дипломированным медицинским работником или студентом медицинского образовательного учреждения.

Куликова К.С.

ФГБУ «Эндокринологический научный центр», Москва

Колодкина А.А.

ФГУ ЭНЦ

Васильев Е.В.

ФГБУ «Эндокринологический научный центр», Москва

Петров В.М.

ФГБУ «Эндокринологический научный центр» Минздрава России, Москва, Россия

Горбач Е.Н.

ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России, Курган, Россия

Гофман Ф.Ф.

ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России, Курган, Россия

Коркин А.Я.

ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия им. акад. Г.А. Илизарова» Минздрава России, Курган, Россия

Петров М.А.

ГБУЗ «Морозовская детская городская клиническая больница» Департамента здравоохранения Москвы, Москва, Россия

Кенис В.М.

ФГБУ«Научно-исследовательский детский ортопедический институт им. Г.И. Турнера» Минздрава России, Санкт-Петербург, Россия

Тюльпаков А.Н.

Эндокринологический научный центр, Москва

Клинические, гормонально-биохимические и молекулярно-генетические характеристики 75 пациентов с гипофосфатемическим рахитом

Авторы:

Куликова К.С., Колодкина А.А., Васильев Е.В., Петров В.М., Горбач Е.Н., Гофман Ф.Ф., Коркин А.Я., Петров М.А., Кенис В.М., Тюльпаков А.Н.

Подробнее об авторах

Журнал: Проблемы эндокринологии. 2016;62(2): 31‑36

Просмотров: 536

Загрузок: 9

Как цитировать:

Куликова К.С., Колодкина А.А., Васильев Е.В., Петров В.М., Горбач Е.Н., Гофман Ф.Ф., Коркин А.Я., Петров М.А., Кенис В.М., Тюльпаков А.Н. Клинические, гормонально-биохимические и молекулярно-генетические характеристики 75 пациентов с гипофосфатемическим рахитом. Проблемы эндокринологии. 2016;62(2):31‑36.
Kulikova KS, Kolodkina AA, Vasil’eva EV, Petrov VM, Gorbach EN, Gofman FF, Korkin AYa, Petrov MA, Kenis VM, Tiul'pakov AN. Clinical, hormonal, biochemical and genetic characteristics of 75 patients with hypophosphatemic rickets. Problemy Endokrinologii. 2016;62(2):31‑36. (In Russ.).
https://doi.org/10.14341/probl201662231-36

?>

Гипофосфатемический рахит (ГФР), или витамин-D-резистентный рахит (ВДРР) — группа заболеваний, характеризующаяся развитием рахитических изменений костной ткани вследствие повышенного выведения фосфора из организма [1—3]. Основными клиническими признаками ГФР являются задержка роста, прогрессирующие деформации ног с момента начала ходьбы, мышечная слабость, боль в костях, позднее прорезывание зубов или их частый кариес и абсцессы. В зрелом возрасте развиваются нефрокальциноз, кальцификация связок, артрозы крупных суставов, остеопороз. При некоторых формах ГФР имеется нейросенсорная тугоухость. Из-за гетерогенности клинической картины диагностика гфр часто запаздывает, что ведет к неправильной тактике лечения. В РФ до настоящего времени отсутствуют данные о распространенности ГФР, а также алгоритмы диагностики и лечения этой патологии. Не проводились и исследования молекулярно-генетических основ данной группы заболеваний.

Цель исследования — определить клинические, гормонально-биохимические и молекулярно-генетические характеристики ГФР.

Материал и методы

Диагноз ГФР основывался на наличии клинических (рахитические деформации скелета, деформации ног с момента начала ходьбы, задержка физического развития, спонтанные абсцессы зубов) и рентгенологических признаков рахита (деформации трубчатых костей, разряжение зон метафизов), а также лабораторных показателей (гипофосфатемия, гиперфосфатурия, гиперкальциурия). Расчет тубулярной реабсорбции фосфатов (TRP, %) производили по формуле:

где Pph — уровень фосфатов в плазме (ммоль/л), PCr — уровень креатинина в плазме (ммоль/л), Uph — уровень фосфатов в моче (ммоль/л), UCr — уровень креатинина в моче (ммоль/л). За норму принимали значения trp в интервале 85—95%. Данный показатель можно измерять в любое время суток [4].

Формулы для вычисления максимальной реабсорбции фосфатов с поправкой на СКФ (TmP/GFR, ммоль/л) зависели от значения trp. При TRP ≤86%

TmP/GFR=TRP路Pph,

а при TRP ≥86%

TmP/GFR=0,3·TRP/(1–0,8·TRP)·Pph.

Полученные значения сравнивали с референсными показателями для пациентов соответствующего пола и возраста (Payne, 1998).

Для вычисления индексов реабсорбции фосфатов необходимо одновременно производить забор крови из вены для определения уровней фосфора и креатинина) и определять эти показатели определять во вторичной разовой порции мочи. Гиперкальциурию диагностировали при соотношении Ca/креатинин в разовой порции мочи >0,8.

Геномную днк пациентов выделяли из периферических лейкоцитов с использованием стандартных методов. Молекулярно-генетический анализ проводили методом высокопроизводительного параллельного секвенирования с использованием панели Custom Ion Ampliseq («Life Technologies», США), включавшей праймеры для мультиплексной амплификации 22 генов, ассоциированных с наследственными нарушениями фосфорно-кальциевого обмена. Найденные миссенс-мутации аннотировались с помощью программы ANNOVAR, которая позволяет сравнивать список однонуклеотидных замен, полученных по результатам секвенирования, с рядом специализированных баз данных [5].

Данное исследование одобрено локальным этическим комитетом Эндокринологического научного центра Минздрава России (протокол № 12 от 22.10.14). Письменное информированное согласие было получено от всех пациентов или их родителей/официальных опекунов в соответствии с протоколом исследования.

Результаты

Клинические и гормонально-биохимические характеристики.

Обследовали 75 пациентов (38 женщин и 37 мужчин в возрасте от 3 мес до 57 лет) с клиническими и биохимическими признаками гфр; семейная форма патологии была диагностирована у 36 пациентов, спорадическая — у 39. ГФР чаще всего манифестировал деформациями нижних конечностей с момента начала ходьбы (94,5%), гипотонией на первом году жизни (70,2%), множественным кариесом зубов (58%). Пациенты старшей возрастной группы предъявляли жалобы на быструю утомляемость при ходьбе, тугоподвижность суставов, спонтанные абсцессы зубов. У 47 пациентов имелось отставание в физическом развитии: медиана (Ме) роста составила –2,48 SD [–3,55; –1,53]. Самые низкие показатели роста отмечены в группе пациентов старше 18 лет (n=30), которые перенесли многократные операции по коррекции деформаций ног (ME роста –3,3 [–4,3; –2,21]). Данные лабораторных исследований: уровень неорганического фосфора в крови — Me = 0,79 ммоль/л [0,68; 0,92]; уровень паратгормона — Me = 59 пг/мл [37,9; 75]; Mе TRP =72,5% [65,8; 80]; Me TMP/GFR = 0,58 ммоль/л [0,46; 0,7]. У 65 пациентов показатели экскреции кальция соответствовали норме, у 4 пациентов выявлена гиперкальциурия.

Молекулярно-генетические характеристики

Генетическая причина заболевания была определена у 68 (90,5%) пациентов. Все обнаруженные мутации локализовались в гене PHEX, из них ранее были описаны 18, ранее не описанных оказалось 40 [21]. При семейных формах патологии мутации были обнаружены в 100% случаев, при спорадических — в 82%. Дефекты гена PHEX включали инсерции и делеции со сдвигом рамки считывания (n=16), нонсенс-мутации (n=12), миссенс-мутации (n=14), делеции без сдвига рамки считывания (n=6), нарушение сплайсинга (n=9). У 1 пациента дефект гена PHEX (c.520_521insTTCAAGCACGG p. i174fs) сочетался с гетерозиготной мутацией в гене DMP1 (с. 475 C>A p. Q159K). У 7 пациентов ни в одном из генов-кандидатов мутаций не выявлено. Характерно, что у всех них заболевание было спорадическим.

Обсуждение

Нами впервые в России исследованы 10 генов-кандидатов (PHEX, FGF23, DMP1, ENNP1, SLC34A1, SLC34A3, SLC9A3R1, SLC2A2, KL) у пациентов с гфр, а также проанализированы корреляции «генотип — фенотип». Дефект гена PHEX выявлен у всех пациентов с семейной формой и у 39 (82%) пробандов со спорадической формой заболевания. По типу наследования различают несколько форм ГФР; наиболее распространена Х-сцепленная доминантная форма (X-linked hypophosphatemia, XLH; MIM 307 800), частота которой составляет 1:20 000 родившихся. Данная форма ГФР обусловлена дефектами в гене PHEX (MIM 300550) [6, 7]. Менее распространены аутосомно-доминантная (ген FGF23, MIM 605380) [8], аутосомно-рецессивные (гены DMP1, MIM 600980; ENPP1, MIM 173335 и SLC34A3, MIM 609826) [9—12] и X-сцепленная рецессивная (ген CLCN5, MIM 300008) формы [13].

Биохимическими и гормональными маркерами гфр служат гипофосфатемия на фоне гиперфосфатурии, повышение активности щелочной фосфатазы, нормальный или умеренно повышенный уровень паратгормона при нормокальциемии. Концентрация 1,25 (OH)2D в сыворотке и степень кальциурии зависят от молекулярной основы заболевания [14].

По данным зарубежных исследований [15—20], в больших когортах пациентов с гфр поломки гена PHEX определяются в 50—80% случаев. С. Gaucher и соавт. [21] обнаружили дефекты гена PHEX в 79%, Y. Kinoshita и соавт. [22] — в 96% случаев. В нашем исследовании соответствующая величина составила 90,5%. Все это подтверждает роль инактивирующих мутаций гена PHEX как основной причины ГФР.

Ген PHEX (Phosphate regulating gene with Homology to Endopeptidases located on the X chromosome), включающий 22 экзона, кодирует протеин из 749 ааминокислот, который по своей структуре и функциям на 60—70% сходен с ферментами семейства M13 металлопептидаз. К ним относятся нейтральная эндопептидаза (NEP), эндотелин-превращающие факторы 1 и 2 (ECE-1 и 2) и Kell-антиген. Эти белки являются мембранными гликопротеинами, участвующими в расщеплении пептидных гормонов. В структуре пептидаз выделяют короткий N-концевой фрагмент, гидрофобный трансмембранный домен и большой C-внеклеточный домен с двумя Zn-связывающими мотивами и консервативными цистеиновыми остатками. Последний участок белка играет роль каталитического центра [3, 23]. Полагали, что продукт гена PHEX принимает участие в деградации фосфотонина FGF23. При инактивации этого гена концентрация FGF23 в крови в большинстве случаев возрастает, что снижает экспрессию генов SLC34A1 и SLC34A3, кодирующих натрий-фосфорные котранспортеры 2-го типа (соответственно NaPi-IIa и NaII-IIc). Эти котранспортеры регулируют реабсорбцию фосфора в проксимальных почечных канальцах; снижение их числа и активности ведет к потере организмом этого элемента. FGF23 также подавляет активность 1α-гидроксилазы (CEP27B1), которая образует активную форму витамина D (кальцитриол) и, наоборот, активирует 24-гидроксилазу (CYP24A1), превращающую кальцитриол в неактивные метаболиты [24].

Внутриклеточный фосфат принимает участие в аккумуляции энергии в виде АТФ, является неотъемлемой частью молекул днк и рнк, а также субстратом киназ и фосфатаз в клетке; внеклеточный фосфат необходим для построения кристаллов гидроксиапатита костного матрикса. Резкое снижение концентрации фосфора в крови может приводить к острой миопатии, сердечной дисфункции, нарушению целостности мембран нейтрофилов, тромбоцитов и эритроцитов. Следствием хронической недостаточности фосфора является нарушение минерализации костей и развитие рахита.

Однако, гены PHEX и FGF23 экспрессируются в остеобластах и остеоцитах, исследования на HYP-мышах (модель ГФР) не подтверждают прямого взаимодействия продуктов данных генов. Предполагается существование в данной системе пока неизвестного промежуточного фактора (рис. 1) [25—27].

Рис. 1. Схема метаболизма фосфора в организме человека.

Выявленные в нашем исследовании мутации локализовались по всей длине гена phex, с наибольшей плотностью в 3’-концевых участках и наиболее часто в экзонах 3, 5, 15, 17, 18, 22 (рис. 2).

Рис. 2. Распределение выявленных в данном исследовании мутаций в гене PHEX.

Среди выявленных мутаций 17% встречались более чем один раз: I174fs (n=2), P549X (n=2), G579R (n=4), Q133X (n=2), Q197Q (n=2) и R747X (n=2). Выявленные нами дефекты часто наблюдались и в других исследованиях [6, 17, 21], что может указывать на наличие регионов в гене, особенно подверженных перестройкам [28]. Замена аргинина на глицин в кодоне 579 (p.g579r) экзона 17 была обнаружена у трех несвязанных между собой пациентов и двух двоюродных братьев; аналогичный дефект был описан ранее у пациентов немецкого, польского, испанского и корейского происхождения. Эта мутация представляет большой интерес, так как находится рядом с высококонсервативным Zn-связывающим участком фермента. Y. Sabbagh и соавт. [23] показали, что при таком дефекте белок менее устойчив к гликозилированию, быстрее подвергается внутриклеточной деградации и тем самым теряет способность встраиваться в плазматическую мембрану.

Белок PHEX содержит 10 высококонсервативных остатков цистеина, которые необходимы для формирования его структуры и каталитической активности. Нами было выявлено 14 различных миссенс-мутаций, одна из которых обусловливала замену цистеина на тирозин в положении 733 (C733Y). Ранее в этом же кодоне была описана замена цистеина на серин (C733S) [16]. Потеря остатка цистеина приводит к нарушению правильной упаковки белка из-за потерь дисульфидных связей. Замена тимина на гуанин (с.2192T>G p. F731C) в этом же экзоне гена PHEX, напротив, способствовала образованию нового цистеинового остатка c заменой консервативного фенилаланина. Другой функционально значимой перестройкой является замена пролина на серин в положении 534, которая может снижать гидрофобность белка и тем самым нарушать идентификацию лигандом области связывания [29].

Нонсенс-мутации в данном исследовании составили 21%, 5 из них (W88X, L45X, E304X, Y317X, S607X) считаются новыми, 7 были описаны ранее. Формирование стоп-кодона приводит к синтезу нефункционального белка.

Большие делеции составляют до 10% всех мутаций гена PHEX. T. Pekkarinen и соавт. [30] обнаружили делеции экзонов 8—11, а Y. Kinoshita и соавт. [22]— экзонов 12—22. В нашем исследовании делеции экзонов составили 10,7%. У одного мальчика ген PHEX полностью отсутствовал. У двоих выявлены делеции экзонов 18, 21 и 22. В данных экзонах расположены высококонсервативные остатки цистеина, поэтому можно предположить, что их потеря приводит к нарушению формирования вторичной структуры белка.

В литературе имеется описание пациентов с сочетанием дефектов гена PHEX с мутациями в генах DMP1, FGF23 [19]. Среди пациентов нашей когорты только у одного выявлена гемизиготная мутация в гене PHEX (p.I174fs) и гетерозиготная мутация в гене DMP1 (р.Q159K), которая была ранее описана [19]. Моноаллельная замена р. Q159K в гене DMP1 по предикторам базы данных ANNOVAR аннотирована как «условно патогенная» и, вероятнее всего, не влияет на развитие заболевания. В единичных случаях обнаруживаются гомозиготные мутации гена DMP1 у пациентов с аутосомно-рецессивной формой ГФР; большинство таких мутаций также локализуется в экзоне 6 [9, 31].

Проведение молекулярно-генетической диагностики в раннем возрасте позволяет своевременно начать консервативное лечение, которое может улучшить структуру костной ткани и конечный рост, а также уменьшить необходимость коррегирующих операций [7, 14, 32]. В настоящее время общепринятой схемой лечения является использование препаратов фосфора и активной формы витамина D. Однако результаты данной терапии неудовлетворительны. В последние годы показана высокая эффективность терапии с применением моноклональных антител к FGF23, которые нормализуют уровень фосфора в крови и уменьшают тяжесть клинических проявлений заболевания у взрослых пациентов [33].

Вопросы, касающиеся выбора лечебной тактики и возраста проведения оперативной коррекции деформаций нижних конечностей, остаются открытыми [34].

Заключение

Проведенное исследование позволило установить причину заболевания практически у всей когорты пациентов. Метод высокопроизводительного параллельного секвенирования дает возможность одновременно выявлять поломки во всех генах-кандидатах, участвующих в регуляции фосфорно-кальциевого обмена. Полученные результаты подтвердили преобладание дефектов гена PHEX среди причин ГФР. Сложность строения, а также большой размер этого гена экономически оправдывают использование данного метода для молекулярно-генетической диагностики. Определение этиологического фактора имеет большое значение для пренатальной диагностики семейных форм заболевания, а также позволяет своевременно назначать консервативное лечение.

Дополнительная информация

Финансирование исследования

Исследование проведено при финансовой поддержке благотворительного фонда «Линия жизни», благотворительного проекта «Альфа-Эндо».

Конфликт интересов

Конфликт интересов авторов данного исследования отсутствует.

Благодарности

Данное исследование стало возможным при поддержке руководителя благотворительного фонда «Линия жизни» Фаины Захаровой, руководителя благотворительного проекта «Альфа-Эндо» Анны Карпушкиной.

Подтверждение e-mail

На test@yandex.ru отправлено письмо с ссылкой для подтверждения e-mail. Перейдите по ссылке из письма, чтобы завершить регистрацию на сайте.

Подтверждение e-mail